JL
Johan Ledin
Author with expertise in Zebrafish as a Model Organism for Multidisciplinary Research
Achievements
Cited Author
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
5
(40% Open Access)
Cited by:
1,166
h-index:
19
/
i10-index:
24
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9

Gaurav Varshney et al.Jun 5, 2015
The use of CRISPR/Cas9 as a genome-editing tool in various model organisms has radically changed targeted mutagenesis. Here, we present a high-throughput targeted mutagenesis pipeline using CRISPR/Cas9 technology in zebrafish that will make possible both saturation mutagenesis of the genome and large-scale phenotyping efforts. We describe a cloning-free single-guide RNA (sgRNA) synthesis, coupled with streamlined mutant identification methods utilizing fluorescent PCR and multiplexed, high-throughput sequencing. We report germline transmission data from 162 loci targeting 83 genes in the zebrafish genome, in which we obtained a 99% success rate for generating mutations and an average germline transmission rate of 28%. We verified 678 unique alleles from 58 genes by high-throughput sequencing. We demonstrate that our method can be used for efficient multiplexed gene targeting. We also demonstrate that phenotyping can be done in the F 1 generation by inbreeding two injected founder fish, significantly reducing animal husbandry and time. This study compares germline transmission data from CRISPR/Cas9 with those of TALENs and ZFNs and shows that efficiency of CRISPR/Cas9 is sixfold more efficient than other techniques. We show that the majority of published “rules” for efficient sgRNA design do not effectively predict germline transmission rates in zebrafish, with the exception of a GG or GA dinucleotide genomic match at the 5′ end of the sgRNA. Finally, we show that predicted off-target mutagenesis is of low concern for in vivo genetic studies.
0
Citation475
0
Save
0

Amyloid precursor protein-b facilitates cell adhesion during early development in zebrafish

Rakesh Banote et al.Oct 5, 2019
Understanding the biological function of β-amyloid precursor protein (APP) beyond its role in Alzheimer's disease is emerging. Yet, its function during embryonic development is poorly understood. The zebrafish APP homologue, Appb is strongly expressed during early development but has so far only been studied via morpholino-mediated knockdown. Zebrafish enables analysis of cellular processes in an ontogenic context, which is limited in many other vertebrates. We characterized zebrafish carrying a homozygous mutation that introduces a premature stop in exon 2 of the appb gene. We report that appb mutants are significantly smaller until 2dpf and display perturbed enveloping layer (EVL) integrity and cell protrusions at the blastula stage. Moreover, appb mutants surviving beyond 48 hpf exhibited no behavioral defects at 6 dpf and developed into healthy and fertile adults. The expression of app-family members, appa and aplp2, was found to be altered in mutants. Taken together, we show that appb orchestrates the initial development by supporting the integrity of the EVL, likely by mediating cell adhesion properties. The loss of Appb might be compensated for by other app family members to be able to implement continued normal development.
0

Zebrafish larvae as a model system for systematic characterization of drugs and genes in dyslipidemia and atherosclerosis

Manoj Bandaru et al.Dec 20, 2018
Background Hundreds of loci have been robustly associated with circulating lipids, atherosclerosis and coronary artery disease; but for most loci the causal genes and mechanisms remain uncharacterized.Methods We developed a semi-automated experimental pipeline for systematic, quantitative, large-scale characterization of mechanisms, drugs and genes associated with dyslipidemia and atherosclerosis in a zebrafish model system. We validated our pipeline using a dietary (n>2000), drug treatment (n>1000), and genetic intervention (n=384), and used it to characterize three candidate genes in a GWAS-identified pleiotropic locus on chr 19p13.11 (n>500).Results Our results show that five days of overfeeding and cholesterol supplementation had independent pro-atherogenic effects, which could be diminished by concomitant treatment with atorvastatin and ezetimibe. CRISPR-Cas9-induced mutations in orthologues of proof-of-concept genes resulted in higher LDL cholesterol levels ( apoea ), and more early stage atherosclerosis ( apobb.1 ). Finally, our pipeline helped identify putative causal genes for circulating lipids and early-stage atherosclerosis ( LPAR2 and GATAD2A ).Conclusions In summary, our pipeline facilitates systematic, in vivo characterization of drugs and candidate genes to increase our understanding of disease etiology, and can likely help identify novel targets for therapeutic intervention.