Bacterial CRISPR-Cas systems protect their host from bacteriophages and other mobile genetic elements. Mobile elements, in turn, encode various anti-CRISPR (Acr) proteins to inhibit the immune function of CRISPR-Cas. To date, Acr proteins have been discovered for type I (subtypes I-D, I-E, and I-F) and type II (II-A and II-C) but not other CRISPR systems. Here, we report the discovery of 12 acr genes, including inhibitors of type V-A and I-C CRISPR systems. AcrVA1 inhibits a broad spectrum of Cas12a (Cpf1) orthologs-including MbCas12a, Mb3Cas12a, AsCas12a, and LbCas12a-when assayed in human cells. The acr genes reported here provide useful biotechnological tools and mark the discovery of acr loci in many bacteria and phages.

Abstract Bacteriophages from the Inoviridae family (inoviruses) are characterized by their unique morphology, genome content and infection cycle. One of the most striking features of inoviruses is their ability to establish a chronic infection whereby the viral genome resides within the cell in either an exclusively episomal state or integrated into the host chromosome and virions are continuously released without killing the host. To date, a relatively small number of inovirus isolates have been extensively studied, either for biotechnological applications, such as phage display, or because of their effect on the toxicity of known bacterial pathogens including Vibrio cholerae and Neisseria meningitidis . Here, we show that the current 56 members of the Inoviridae family represent a minute fraction of a highly diverse group of inoviruses. Using a machine learning approach leveraging a combination of marker gene and genome features, we identified 10,295 inovirus-like sequences from microbial genomes and metagenomes. Collectively, our results call for reclassification of the current Inoviridae family into a viral order including six distinct proposed families associated with nearly all bacterial phyla across virtually every ecosystem. Putative inoviruses were also detected in several archaeal genomes, suggesting that, collectively, members of this supergroup infect hosts across the domains Bacteria and Archaea. Finally, we identified an expansive diversity of inovirus-encoded toxin–antitoxin and gene expression modulation systems, alongside evidence of both synergistic (CRISPR evasion) and antagonistic (superinfection exclusion) interactions with co-infecting viruses, which we experimentally validated in a Pseudomonas model. Capturing this previously obscured component of the global virosphere may spark new avenues for microbial manipulation approaches and innovative biotechnological applications.

SUMMARY Bacteria deploy multiple defense mechanisms to prevent the invasion of mobile genetic elements (MGEs). CRISPR-Cas systems use RNA-guided nucleases to target MGEs, which in turn produce anti-CRISPR (Acr) proteins that inactivate Cas protein effectors. The minimal component Type I-C CRISPR-Cas subtype is highly prevalent in bacteria, and yet a lack of a tractable in vivo model system has slowed its study, the identification of cognate Acr proteins, and thus our understanding of its true role in nature. Here, we describe MGE-MGE conflict between a mobile Pseudomonas aeruginosa Type I-C CRISPR-Cas system always encoded on pKLC102-like conjugative elements, which are large mobile islands, and seven new Type I-C anti-CRISPRs (AcrIF2*, AcrIC3-IC8) encoded by phages, other mobile islands, and transposons. The P. aeruginosa Type I-C system possesses a total of 300 non-redundant spacers (from 980 spacers total) across the 42 genomes analyzed, predominantly targeting P. aeruginosa phages. Of the seven new Type I-C anti-CRISPRs, all but one are highly acidic, and four have surprisingly broad inhibition activity, blocking multiple distantly related P. aeruginosa Type I CRISPR system subtypes (e.g. I-C and I-F, or I-C and I-E), including AcrIF2 (now, AcrIF2*), a previously described DNA mimic. Anti-type I-C activity of AcrIF2* was far more sensitive to mutagenesis of acidic residues in AcrIF2* than anti-type I-F activity, suggesting distinct binding mechanisms for this highly negatively charged protein. Five of the seven Acr proteins block DNA-binding, while the other two act downstream of DNA-binding, likely by preventing Cas3 recruitment or activity. For one such Cas3 inhibitor (AcrIC3), we identify a novel anti-CRISPR evasion strategy: a cas3-cas8 gene fusion, which also occurs in nature. Collectively, the Type I-C CRISPR spacer diversity and corresponding anti-CRISPR response, all occurring on Pseudomonas MGEs, demonstrates an active co-evolutionary battle between parasitic elements.

Abstract The genetic code is a highly conserved feature of life. However, some “alternative” genetic codes use reassigned stop codons to code for amino acids. Here, we survey stop codon recoding across bacteriophages (phages) in human and animal gut microbiomes. We find that stop codon recoding has evolved in diverse clades of phages predicted to infect hosts that use the standard code. We provide evidence for an evolutionary path towards recoding involving reduction in the frequency of TGA and TAG stop codons due to low GC content, followed by acquisition of suppressor tRNAs and the emergence of recoded stop codons in structural and lysis genes. In analyses of two distinct lineages of recoded virulent phages, we find that lysis-related genes are uniquely biased towards use of recoded stop codons. This convergence supports the inference that stop codon recoding is a strategy to regulate the expression of late stage genes and control lysis timing. Interestingly, we identified prophages with recoded stop codons integrated into genomes of bacteria that use standard code, and hypothesize that recoding may control the lytic-lysogenic switch. Alternative coding has evolved many times, often in closely related lineages, indicating that genetic code is plastic in bacteriophages and adaptive recoding can occur over very short evolutionary timescales.

Abstract Metagenomic findings suggesting that bacteriophages (phages) can use genetic codes different from those of their host bacteria reveal a new dimension of phage-host interaction dynamics. Whereas reassignment of stop codons to code for amino acids has been predicted, there has been no proteomic validation of alternative coding in phages. In fact, one code where the stop codon TAG is reassigned to glutamine (code 15) has never been experimentally validated in any biological system. Here, we characterized stop codon reassignment in two crAss-like phages found in the human gut microbiome using LC-MS/MS-based metaproteomics. The proteome data from several phage structural proteins clearly demonstrates reassignment of the TAG stop codon to glutamine, establishing for the first time the expression of genetic code 15. One-Sentence Summary Mass spectrometry confirms protein expression of predicted alternate genetic coding in phage genomes from human microbiomes.

Abstract The ribosomal protein S21 (bS21) gene has been detected in diverse viruses with a large range of genome sizes, yet its in situ expression and potential significance have not been investigated. Here, we report five closely related clades of bacteriophages (phages) represented by 47 genomes (8 curated to completion and up to 331 kbp in length) that encode a bS21 gene. The bS21 gene is on the reverse strand within a conserved region that encodes the large terminase, major capsid protein, prohead protease, portal vertex proteins and some hypothetical proteins. These phages are predicted to infect Bacteroidetes species that inhabit a range of depths in freshwater lakes. Transcriptionally active bS21-encoding phages were sampled in the late-stage of replication, when core structural genes, bS21 and a neighboring gene of unknown function were highly expressed. Thus, our analyses suggest that bS21, which is involved in translation initiation, substitutes into the Bacteroidetes ribosomes and selects for phage transcripts during the late-stage replication when large-scale phage protein production is required for assembly of phage particles.

Abstract Bacteriophages are key components of gut microbiomes, yet the phage colonization process in the infant gut remains uncertain. Here, we established a large phage sequence database and used strain-resolved analyses to investigate phage succession in infants throughout the first three years of life. Analysis of 819 fecal metagenomes collected from 28 full-term and 24 preterm infants and their mothers revealed that early-life phageome richness increased over time and reached adult-like complexity by age three. Approximately 9% of early phage colonizers, mostly maternally transmitted and infecting Bacteroides , persisted for three years and were more prevalent in full-term than in preterm infants. Although rare, phages with stop codon reassignment were more likely to persist than non-recoded phages and generally displayed an increase in in-frame re-assigned stop codons over three years. Overall, maternal seeding, stop codon reassignment, host CRISPR-Cas locus prevalence, and diverse phage populations contribute to stable viral colonization.

Abstract CRISPR-Cas systems provide their prokaryotic hosts with adaptive immunity against mobile genetic elements. Many bacteriophages encode anti-CRISPR (Acr) proteins that inhibit host defense. The identification of Acr proteins is challenging due to their small size and high sequence diversity, and only a limited number has been characterized to date. In this study, we report the discovery of a novel Acr protein, AcrIB2, encoded by the φCD38-2 Clostridioides difficile phage that efficiently inhibits interference by the type I-B CRISPR-Cas system of the host and likely acts as a DNA mimic. Most C. difficile strains contain two cas operons, one encoding a full set of interference and adaptation proteins and another encoding interference proteins only. Unexpectedly, we show that only the partial operon is required for interference and is subject to inhibition by AcrIB2.

Abstract Human milk oligosaccharides (HMOs) ensure proper infant gut microbiome establishment. Isolate studies have revealed the genetic basis for HMO metabolism, but they exclude the possibility of HMO assimilation via synergistic interactions involving multiple organisms. Here, we investigated microbiome responses to 2’-fucosyllactose (2’FL), a prevalent HMO and infant formula additive, by establishing individualized microbiomes using fecal samples from three different infants as the inocula. Bifidobacterium breve , a prominent member of infant microbiomes, typically cannot metabolize 2’FL. Using metagenomic data, we predicted that extracellular fucosidases encoded by co-existing members such as Ruminococcus gnavus initiate 2’FL breakdown, thus critical for B. breve’s growth. Using both targeted co-cultures and by supplementation of R. gnavus into one microbiome, we show that R. gnavus can promote extensive growth of B. breve through the release of lactose from 2’FL. Overall, microbiome cultivation combined with genome-resolved metagenomics demonstrated that HMO utilization can vary with an individual’s microbiome.

Abstract Phage-encoded anti-CRISPR (Acr) proteins inhibit CRISPR-Cas systems to allow phage replication and lysogeny maintenance. Most of the Acrs characterized to date are stable stoichiometric inhibitors, and while enzymatic Acrs have been characterized biochemically, little is known about their potency, specificity, and reversibility. Here, we examine AcrIF11, a widespread phage and plasmid-encoded ADP-ribosyltransferase (ART) that inhibits the Type I-F CRISPR-Cas system. We present an NMR structure of an AcrIF11 homolog that reveals chemical shift perturbations consistent with NAD (cofactor) binding. In experiments that model both lytic phage replication and MGE/lysogen stability under high targeting pressure, AcrIF11 is a highly potent CRISPR-Cas inhibitor and more robust to Cas protein level fluctuations than stoichiometric inhibitors. Furthermore, we demonstrate that AcrIF11 is remarkably specific, predominantly ADP-ribosylating Csy1 when expressed in P. aeruginosa . Given the reversible nature of ADP-ribosylation, we hypothesized that ADPr eraser enzymes (macrodomains) could remove ADPr from Csy1, a potential limitation of PTM-based CRISPR inhibition. We demonstrate that diverse macrodomains can indeed remove the modification from Csy1 in P. aeruginosa lysate. Together, these experiments connect the in vitro observations of AcrIF11’s enzymatic activity to its potent and specific effects in vivo , clarifying the advantages and drawbacks of enzymatic Acrs in the evolutionary arms race between phages and bacteria.