Abstract Cholestatic itch is a severe and debilitating symptom in liver diseases with limited treatment options. The class A G protein-coupled receptor (GPCR) Mas-related GPCR subtype X4 (MRGPRX4) has been identified as a receptor for bile acids, which are potential cholestatic pruritogens. An increasing number of GPCRs have been shown to interact with receptor activity-modifying proteins (RAMPs), which can modulate different aspects of GPCR biology. Using a combination of multiplexed immunoassay and proximity ligation assay we show that MRGPRX4 interacts with RAMPs. The interaction of MRGPRX4 with RAMP2, but not RAMP1 or 3, causes attenuation of basal and agonist-dependent signaling, which correlates with a decrease of MRGPRX4 cell surface expression as measured using a quantitative NanoBRET pulse-chase assay. Finally, we use AlphaFold Multimer to predict the structure of the MRGPRX4-RAMP2 complex. The discovery that RAMP2 regulates MRGPRX4 may have direct implications for future drug development for cholestatic itch.

The G protein-coupled receptor (GPCR) cysteinyl-leukotriene receptor 2 (CysLTR2) with a single amino acid mutation at position 3.43 (Leu replaced with Gln at position 129 in transmembrane helix 3) causes uveal melanoma in humans. The ability of CysLTR2-L129Q to cause malignant transformation has been hypothesized to result from constitutive activity. We show that CysLTR2-L129Q is a constitutively active mutant (CAM) that strongly drives Gq/11 signaling pathways in melan-a melanocytes and in HEK293T cells in culture. However, the mutant receptor only very weakly recruits beta-arrestins 1 and 2. The mutant receptor displays profound signaling bias while avoiding arrestin-mediated downregulation. The mechanism of the signaling bias results from the creation of a hydrogen-bond network that stabilizes the active G protein signaling state through novel interactions with the highly-conserved NPxxY motif on helix 7. Furthermore, the mutation destabilizes a putative allosteric sodium-binding site that usually stabilizes the inactive state of GPCRs. Thus, the mutation has a dual role of promoting the active state while destabilizing inactivating allosteric networks. The high degree of constitutive activity renders existing orthosteric antagonist ligands of CysLTR2 ineffective as inverse agonists of the mutant. CysLTR2 is the first example of a GPCR oncogene that encodes a GPCR with constitutive highly biased signaling that can escape cellular downregulation mechanisms.

The chemokine receptor CCR5 is a drug target to prevent transmission of HIV/AIDS. We studied four analogs of the native chemokine RANTES (CCL5) that have anti-HIV potencies of around 25 pM, which is more than four orders-of-magnitude higher than that of RANTES itself. It has been hypothesized that the ultra-high potency of the analogs is due to their ability to bind populations of receptors not accessible to native chemokines. To test this hypothesis, we developed a homogeneous dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) assay for saturation and competition binding experiments. The FCCS assay has the advantage that it does not rely on competition with radioactively labeled native chemokines used in conventional assays. We prepared site-specifically labeled fluorescent analogs using native chemical ligation of synthetic peptides, followed by bioorthogonal fluorescent labeling. We engineered a mammalian cell expression construct to provide fluorescently labeled CCR5, which was purified using a tandem immunoaffinity and size-exclusion chromatography approach to obtain monomeric fluorescent CCR5 in detergent solution. We found subnanomolar binding affinities for the two analogs 5P12-RANTES and 5P14-RANTES, and about twenty-fold reduced affinities for PSC-RANTES and 6P4-RANTES. Using homologous and heterologous competition experiments with unlabeled chemokine analogs, we conclude that the analogs all bind at the same binding site; whereas, the native chemokines (RANTES and MIP1α) fail to displace bound fluorescent analogs even at tens of micromolar concentrations. Our results can be rationalized with de novo structural models of the N-terminal tails of the synthetic chemokines that adopt a different binding mode as compared to the parent compound.