Migration through micron-size constrictions has been seen to rupture the nucleus, release nuclear-localized GFP, and cause localized accumulations of ectopic 53BP1-a DNA repair protein. Here, constricted migration of two human cancer cell types and primary mesenchymal stem cells (MSCs) increases DNA breaks throughout the nucleoplasm as assessed by endogenous damage markers and by electrophoretic "comet" measurements. Migration also causes multiple DNA repair proteins to segregate away from DNA, with cytoplasmic mis-localization sustained for many hours as is relevant to delayed repair. Partial knockdown of repair factors that also regulate chromosome copy numbers is seen to increase DNA breaks in U2OS osteosarcoma cells without affecting migration and with nucleoplasmic patterns of damage similar to constricted migration. Such depletion also causes aberrant levels of DNA. Migration-induced nuclear damage is nonetheless reversible for wild-type and sub-cloned U2OS cells, except for lasting genomic differences between stable clones as revealed by DNA arrays and sequencing. Gains and losses of hundreds of megabases in many chromosomes are typical of the changes and heterogeneity in bone cancer. Phenotypic differences that arise from constricted migration of U2OS clones are further illustrated by a clone with a highly elongated and stable MSC-like shape that depends on microtubule assembly downstream of the transcription factor GATA4. Such changes are consistent with reversion to a more stem-like state upstream of cancerous osteoblastic cells. Migration-induced genomic instability can thus associate with heritable changes.

Migration through constrictions can clearly rupture nuclei and mis-localize nuclear proteins but damage to DNA remains uncertain as does any effect on cell cycle. Here, myosin-II inhibition rescues rupture and partially rescues the DNA damage marker γH2AX, but an apparent delay in cell cycle is unaffected. Co-overexpression of multiple DNA repair factors and antioxidant inhibition of break formation also have partial effects, independent of rupture. Complete rescue of both DNA damage and cell cycle delay by myosin inhibition plus antioxidant reveals a bimodal dependence of cell cycle on DNA damage. Migration through custom-etched pores yields the same bimodal, with ~4-um pores causing intermediate levels of damage and cell cycle delay. Micronuclei (generated in faulty division) of the smallest diameter appear similar to ruptured nuclei, with high DNA damage and entry of chromatin-binding cGAS (cyclic-GMP-AMP-synthase) from cytoplasm but low repair factor levels. Increased genomic variation after constricted migration is quantified in expanding clones and is consistent with (mis)repair of excess DNA damage and subsequent proliferation.

ABSTRACT Matrix around cells exerts many effects, some of which depend on the putative tumor suppressor Myosin-II, but whether such factors affect DNA sequences in a cell remains unclear. Here, live-cell monitoring of changes to chromosome copy numbers is developed and studied under diverse perturbations, including Myosin-II inhibition in confined mitosis. Squeezing of mitotic cells is seen in vivo and kills in vitro , but stem cells and cancer cells that survive show heritable loss of mono-allelic GFP/RFP-tagged constitutive genes that function as novel Chromosome-reporters (ChReporters). Myosin-II suppression increases such loss in 3D & 2D confinement but not in standard 2D, with “lethal” multipolar divisions proving myosin-dependent. Viable chromosome loss after confined mitosis associates more with mis-segregation than with multipolars or division number. Solid human tumors and teratomas in mice also show ChReporter loss and a confinement-signature of Myosin-II suppression, although losses are selected against in 2D culture. Heritable loss in rigid-confinement also appears independent of a spindle assembly checkpoint that functions in 2D. Confinement and myosin-II thus regulate pathways of heritable mechanogenetic change.

ABSTRACT Nuclear rupture has long been associated with deficits or defects in lamins, with recent results also indicating a role for actomyosin stress, but key physical determinants of rupture remain unclear. Here, lamin-B stably interacts with the nuclear membrane at sites of low Gaussian curvature yet dilutes at high-curvature to favor rupture, whereas lamin-A depletes similarly but only at high strain-rates. Live cell imaging of lamin-B1 gene-edited cancer cells is complemented by fixed-cell imaging of ruptured nuclei in: iPS-derived cells from progeria patients, cells within beating chick embryo hearts, and cancer cells that develop multiple ruptures in migrating through small pores. Dilution and curvature-dependent rupture fit a parsimonious model of a stiff filament that detaches from a curved surface, suggesting an elastic-type response of lamin-B, but rupture is also modestly suppressed by inhibiting myosin-II and by hypotonic stress, which slow the strain rates. Lamin-A dilution and nuclear rupture likelihood indeed increase above a threshold rate of pulling into small pipettes, suggesting a viscoplastic coupling to the envelope for protection against nuclear rupture. Summary statement High nuclear curvature drives lamina dilution and nuclear envelope rupture even when myosin stress is inhibited. Stiff filaments generally dilute from sites of high Gaussian curvature, providing mathematical fits of experiments.

Cancer cell invasion into tissue or narrow capillaries often elongates the nucleus and sometimes damages it, but cell cycle effects are unknown and highly relevant to tumorigenesis. Here, nuclear rupture and DNA breaks caused by constricted migration are quantified in different phases of cell cycle--which is effectively repressed. Cancer lines with varying levels of contact inhibition and lamina proteins exhibit diverse frequencies of nuclear lamina rupture after migration, with pre-rupture dilation of gene-edited RFP-Lamin-B1 preceding DNA repair factor leakage in pressure-controlled distension. Post-migration rupture indeed associates with mis-localized DNA repair factors and increased DNA breaks as quantified by pan-nucleoplasmic foci of γH2AX, with foci counts always suppressed in late cell cycle. When contact-inhibited cells migrate through large pores into sparse microenvironments, cells re-enter cell cycle consistent with release from contact inhibition. In contrast, constricting pores effectively delay re-entry, but the excess DNA damage nonetheless exceeds any cell cycle dependence. Partial depletion of topoisomerase does not strongly affect cell cycle or the excess DNA damage, consistent with weak dependencies on replication stress. Constricted migration thus impacts cell cycle as well as DNA damage.

Cells that migrate through small, rigid pores and that have normal levels of the nuclear structure protein lamin-A exhibit an increase in DNA damage, which is also observed with lamin-A depletion in diseases such as cancer and with many lamin-A mutations. Here we show nuclear envelope rupture is a shared feature that increases in standard culture after lamin-A knockdown, which causes nuclear loss of multiple DNA repair factors and increased DNA damage. Some repair factors are merely mis-localized to cytoplasm whereas others are partially depleted unless rescued by lamin-A expression. Compared to standard cultures on rigid glass coverslips, the growth of lamin-A low cells on soft matrix relaxes cytoskeletal stress on the nucleus, suppresses the mis-localization of DNA repair factors, and minimizes DNA damage nearly to wildtype levels. Conversely, constricted migration of the lamin-A low cells causes abnormally high levels of DNA damage, consistent with sustained loss of repair factors. The findings add insight into why monogenic progeroid syndromes that often associate with increased DNA damage and predominantly impact cells in stiff tissues result from mutations only in lamin-A or DNA repair factors.

Genomic variation across cancers scales with tissue stiffness: meta-analyses show tumors in stiff tissues such as lung and bone exhibit up to 100-fold more variation than tumors in soft tissues such as marrow and brain. Here, nuclear lamina damage and DNA double-strand breaks (DSBs) result from invasive migration of cancer cells through stiff constrictions. DSBs increase with lamin-A knockdown and require micro-pores sufficiently small for lamins to impede migration. Blebs in the vast majority of post-migration nuclei are enriched in lamin-A but deficient in lamin-B and an age-associated form of lamin-A. Validation of DSBs by an electrophoretic comet assay calibrates against a cancer line having nuclease sites engineered in chromosome-1, and DSB-bound repair factors in nuclei pulled into constrictions show folded chromatin orients, extends, and concentrates without fragmentation. Mobile repair proteins simultaneously segregate away from pore-condensed chromatin. Global squeeze-out of repair factors and loss with lamin-A-dependent rupture explains why overexpression of repair factors cannot rescue DSBs in migration through stiff constrictions, ultimately favoring genomic variation.

Cancer cells and pluripotent stem cells frequently exhibit gains or losses of entire chromosomes and chromosome segments, and the typical terminal analyses of genomes suggest this aneuploidy is ongoing and particularly variable in solid tumors. Here, we quantify aneuploidy-inducing perturbations by live cell fluorescence monitoring for changes in chromosome-5 in a lung cancer line and in normal diploid iPS cells. Inhibition of the spindle assembly checkpoint (SAC) and knockdown of DNA repair factors cause chromosome mis-segregation to increase several-fold above a low baseline level, and both perturbations also generate several-fold more rare fluorescent-null cells. Loss of chromosome-5 is confirmed by single cell karyotyping, SNP arrays on stable isolated clones, and downregulated expression of genes on chromosome-5 in single cell transcriptomics. The iPS cells also show loss of fluorescence in infrequent cells after SAC inhibition and upon growth as teratomas in mice. Viability, selection, and altered expression can thus be tracked to reveal molecular mechanisms in aneuploidy.