ABSTRACT Metaproteomics has emerged as one of the most promising approaches for determining the composition and metabolic functions of complete microbial communities. Conventional metaproteomics approaches however, rely on the construction of protein sequence databases and efficient peptide-spectrum matching algorithms. Thereby, very large sequence databases impact on computational efforts and sensitivity. More recently, advanced de novo sequencing strategies—which annotate peptide sequences without the requirement for a database—have become (again) increasingly proposed for proteomics applications. Such approaches would vastly expand many metaproteomics applications by enabling rapid community profiling and by capturing unsequenced community members, which otherwise remain inaccessible for further interpretation. Nevertheless, because of the lack of efficient pipelines and validation procedures, those strategies have only rarely been employed for community proteomics. Here we report on a newly established de novo metaproteomics pipeline which was evaluated for its quantitative performance using synthetic and natural communities. Additionally, we introduce a novel validation strategy and investigate the actual content of community members within community proteomics data.

Environmental fluctuations in the availability of nutrients lead to intricate metabolic strategies. Candidatus Accumulibacter phosphatis, a polyphosphate accumulating organism (PAO) responsible for enhanced biological phosphorus removal (EBPR) from wastewater treatment systems, is prevalent in aerobic/anaerobic environments. While the overall metabolic traits of these bacteria are well described, the inexistence of isolates has led to controversial conclusions on the metabolic pathways used. Here, we experimentally determined the redox cofactor preference of different oxidoreductases in the central carbon metabolism of a highly enriched Ca. A. phosphatis culture. Remarkably, we observed that the acetoacetyl-CoA reductase engaged in polyhydroxyalkanoates (PHA) synthesis is NADH-preferring instead of the generally assumed NADPH dependency. Based on previously published meta-omics data and the results of enzymatic assays, a reduced central carbon metabolic network was constructed and used for simulating different metabolic operating modes. In particular, scenarios with different acetate-to-glycogen consumption ratios were simulated. For a high ratio (i.e. more acetate), a polyphosphate-based metabolism arises as optimal with a metabolic flux through the glyoxylate shunt. In case of a low acetate-to-glycogen ratio, glycolysis is used in combination with reductive branch of the TCA cycle. Thus, optimal metabolic flux strategies will depend on the environment (acetate uptake) and on intracellular storage compounds availability (polyphosphate/glycogen). This metabolic flexibility is enabled by the NADH-driven PHA synthesis. It allows for maintaining metabolic activity under varying environmental substrate conditions, with high carbon conservation and lower energetic costs compared to NADPH dependent PHA synthesis. Such (flexible) metabolic redox coupling can explain PAOs′ competitiveness under oxygen-fluctuating environments.

What will be the best metabolic strategy in a competitive environment where oxygen is periodically unavailable? A few decades ago, an accidental, man-made cyclic anaerobic/aerobic environment selected for Polyphosphate Accumulating Organisms (PAOs) and this strategy is now widely used to allow for Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR) of wastewater. But could it have been predicted? Here, a dynamic resource allocation modeling formalism was used to analyze the impact of selection pressures on metabolic function. With the same meta-network but modified selective pressures, different successful strategies can be predicted: Polyphosphate-AOs, Glycogen-AOs, Polyhydroxyalkanoate-AOs, and regular aerobic heterotrophs. The results demonstrate how storage metabolism allows for different trade-offs between growth yield, robustness, and competitiveness, and highlight how each metabolic function is an important determining factor for a selective advantage in a given environment. This can be seen as an example of when "Unity in biochemistry" by A.Kluyver meets "Everything is everywhere, but the environment selects" by B.Becking and how microbial ecosystems may be described by the energy allocation phenotype instead of a detailed description of each organism.