Living cells have the capability to synthesize molecular components and precisely assemble them from the nanoscale to build macroscopic living functional architectures under ambient conditions. 1–3 The emerging field of living materials has leveraged microbial engineering to produce materials for various applications, but building 3D structures in arbitrary patterns and shapes has been a major challenge. 1–14 We set out to develop a new bioink, termed as “microbial ink” that is produced entirely from genetically engineered microbial cells, programmed to perform a bottom-up, hierarchical self-assembly of protein monomers into nanofibers, and further into nanofiber networks that comprise extrudable hydrogels. We further demonstrate the 3D printing of functional living materials by embedding programmed Escherichia coli ( E. coli ) cells and nanofibers into microbial ink, which can sequester toxic moieties, release biologics and regulate its own cell growth through the chemical induction of rationally designed genetic circuits. This report showcases the advanced capabilities of nanobiotechnology and living materials technology to 3D-print functional living architectures.

Abstract Bacterial cellulose (BC) has excellent material properties and can be produced cheaply and sustainably through simple bacterial culture, but BC-producing bacteria lack the extensive genetic toolkits of model organisms such as Escherichia coli . Here, we describe a simple approach for producing highly programmable BC materials through incorporation of engineered E. coli . The acetic acid bacterium Gluconacetobacter hansenii was co-cultured with engineered E. coli in droplets of glucose-rich media to produce robust cellulose capsules, which were then colonized by the E. coli upon transfer to selective lysogeny broth media. We show that the encapsulated E. coli can produce engineered protein nanofibers within the cellulose matrix, yielding hybrid capsules capable of sequestering specific biomolecules from the environment and enzymatic catalysis. Furthermore, we produced capsules capable of altering their own bulk physical properties through enzyme-induced biomineralization. This novel system, based on autonomous biological fabrication, significantly expands the functionality of BC-based living materials.

Surface-associated microbial systems are hotspots for the spread of plasmid-encoded antibiotic resistance, but how surface association affects plasmid transfer and proliferation remains unclear. Surface association enables prolonged spatial proximities between different populations, which promotes plasmid transfer between them. However, surface association also fosters strong metabolic interactions between different populations, which can direct their spatial self-organization with consequences for plasmid transfer and proliferation. Here, we hypothesize that metabolic interactions direct the spatial self-organization of different populations and, in turn, regulate the spread of plasmid-encoded antibiotic resistance. We show that resource competition causes populations to spatially segregate, which represses plasmid transfer. In contrast, resource cross-feeding causes populations to spatially intermix, which promotes plasmid transfer. We further show that the spatial positionings that emerge from metabolic interactions determine the proliferation of plasmid recipients. Our results demonstrate that metabolic interactions are important regulators of both the transfer and proliferation of plasmid-encoded antibiotic resistance.

Abstract Surface-associated microbial communities are omnipresent on Earth. As individuals grow and divide within these communities, they undergo range expansion during which different cell-types arrange themselves across space to form spatial patterns (referred to as spatial self-organization). Metabolic interactions are important determinants of the spatial self-organization process, where they direct the spatial positionings of different cell-types. We hypothesized here a previously unexplored consequence of metabolic interactions; by directing the spatial positionings of different cell-types, they also control the horizontal spread of functional novelty during range expansion. We focused on a form of functional novelty of critical importance to human health – the conjugative transfer and proliferation of plasmid-encoded antibiotic resistance. We performed range expansion experiments and spatially-explicit individual-based computational simulations with pairs of strains of the bacterium Pseudomonas stutzeri , where one strain was a plasmid donor and the other a potential recipient. We then imposed a competitive or resource cross-feeding interaction between them. We found that interactions that increase the spatial intermixing of strains also increase plasmid conjugation. We further directly linked these effects to spatial intermixing itself. We finally showed that the ability of plasmid recipients to proliferate is determined by their spatial positionings. Our results demonstrate that metabolic interactions are indeed important determinants of the horizontal spread of functional novelty during microbial range expansion, and that the spatial positionings of different cell-types need to be considered when predicting the proliferation and fate of plasmid-encoded traits.

Nature is home to a variety of microorganisms that create materials under environmentally friendly conditions. While this offers an attractive approach for sustainable manufacturing, the production of materials by native microorganisms is usually slow and synthetic biology tools to engineer faster microorganisms are only available when prior knowledge of genotype-phenotype links is available. Here, we utilize a high-throughput directed evolution platform to enhance the fitness of whole microorganisms under selection pressure and identify genetic pathways to enhance the material production capabilities of native species. Using

Abstract Phage predation is generally assumed to reduce microbial proliferation while not contributing to the spread of antibiotic resistance. However, this assumption does not consider the effect of phage predation on the spatial organization of different microbial populations. Here, we show that phage predation can increase the spread of plasmid-encoded antibiotic resistance during surface-associated microbial growth by reshaping spatial organization. Using two strains of the bacterium Escherichia coli , we demonstrate that phage predation slows the spatial segregation of the strains during growth. This increases the number of cell-cell contacts and the extent of conjugation-mediated plasmid transfer between them. The underlying mechanism is that phage predation shifts the location of fastest growth from the biomass periphery to the interior where cells are densely packed and aligned closer to parallel with each other. This creates straighter interfaces between the strains that are less likely to merge together during growth, consequently slowing the spatial segregation of the strains and enhancing plasmid transfer between them. Our results have implications for the design and application of phage therapy and reveal a mechanism for how microbial functions that are deleterious to human and environmental health can proliferate in the absence of positive selection.

Standardised Type IIS DNA assembly methods are becoming essential for biological engineering and research. Although a ‘common syntax’ has been proposed to enable higher interoperability between DNA libraries, Golden Gate (GG)-based assembly systems remain specific to target organisms. Furthermore, these GG assembly systems become laborious and unnecessarily complicated beyond the assembly of 4 transcriptional units. Here, we describe “universal Loop” (uLoop) assembly, a simple system based on Loop assembly that enables hierarchical fabrication of large DNA constructs (> 30 kb) for any organism of choice. uLoop comprises two sets of four plasmids that are iteratively used as odd and even levels to compile DNA elements in an exponential manner (4n-1). The elements required for transformation/maintenance in target organisms are also assembled as standardised parts, enabling customisation of host-specific plasmids. Thus, this species-agnostic method decouples efficiency of assembly from the stability of vectors in the target organism. As a proof-of-concept, we show the engineering of multi-gene expression vectors in diatoms, yeast, plants and bacteria. These resources will become available through the OpenMTA for unrestricted sharing and open-access.![Figure][1] [1]: pending:yes