Abstract Reconstructing neuron morphology is central to uncovering the complexity of the nervous system. That is because the morphology of a neuron essentially provides the physical constraints to its intrinsic electrophysiological properties and its connectivity. Recent advances in imaging technologies generated large quantities of high-resolution 3D images of neurons in the brain. Furthermore, the multispectral labeling technology, Brainbow permits unambiguous differentiation of neighboring neurons in a densely labeled brain, therefore enables for the first time the possibility of studying the connectivity between many neurons from a light microscopy image. However, lack of reliable automated neuron morphology reconstruction makes data analysis the bottleneck of extracting rich informatics in neuroscience. Supervoxel-based neuron segmentation methods have been proposed to solve this problem, however, the use of previous approaches has been impeded by the large numbers of errors which arise in the final segmentation. In this paper, we present a novel unsupervised approach to trace neurons from multispectral Brainbow images, which prevents segmentation errors and tracing continuity errors using two innovations. First, we formulate a Gaussian mixture model-based clustering strategy to improve the separation of segmented color channels that provides accurate skeletonization results for the following steps. Next, a skeleton graph approach is proposed to allow the identification and correction of discontinuities in the neuron tree topology. We find that these innovations allow our approach to outperform current state-of-the-art approaches, which results in more accurate neuron tracing as a tree representation close to human expert annotation.

Modern high-throughput microscopy methods such as light-sheet imaging and electron microscopy are capable of producing petabytes of data inside of a single experiment. Storage of these large images, however, is challenging because of the difficulty of moving, storing, and analyzing such vast amounts of data, which is often collected at very high data rates (>1GBps). In this report, we provide a comparison of the performance of several compression algorithms using a collection of published and unpublished datasets including confocal, fMOST, and pathology images. We also use simulated data to demonstrate the efficiency of each algorithm as image content or entropy increases. As a result of this work, we recommend the use of the BLOSC algorithm combined with ZSTD for various microscopy applications, as it produces the best compression ratio over a collection of conditions.

Abstract Multipotent neural stem cells (NSCs) are found in several isolated niches of the adult mammalian brain where they have unique potential to assist in tissue repair. Modern transcriptomics offer high-throughput methods for identifying disease or injury associated gene expression signatures in endogenous adult NSCs, but they require adaptation to accommodate the rarity of NSCs. Bulk RNA sequencing (RNAseq) of NSCs requires pooling several mice, which impedes application to labor-intensive injury models. Alternatively, single cell RNAseq can profile hundreds to thousands of cells from a single mouse and is increasingly used to study NSCs. The consequences of the low RNA input from a single NSC on downstream identification of differentially expressed genes (DEGs) remains largely unexplored. Here, to clarify the role that low RNA input plays in NSC DEG identification, we directly compared DEGs in an oxidative stress model of cultured NSCs by bulk and single cell sequencing. While both methods yielded DEGs that were replicable, single cell sequencing DEGs derived from genes with higher relative transcript counts compared to all detected genes and exhibited smaller fold changes than DEGs identified by bulk RNAseq. The loss of high fold-change DEGs in the single cell platform presents an important limitation for identifying disease-relevant genes. To facilitate identification of such genes, we determined an RNA-input threshold that enables transcriptional profiling of NSCs comparable to standard bulk sequencing and used it to establish a workflow for in vivo profiling of endogenous NSCs. We then applied this workflow to identify DEGs after lateral fluid percussion injury, a labor-intensive animal model of traumatic brain injury. Our work suggests that single cell RNA sequencing may underestimate the diversity of pathologic DEGs but population level transcriptomic analysis can be adapted to capture more of these DEGs with similar efficacy and diversity as standard bulk sequencing. Together, our data and workflow will be useful for investigators interested in understanding and manipulating adult hippocampal NSC responses to various stimuli.

Abstract The study of neuron morphology requires robust and comprehensive methods to quantify the differences between neurons of different subtypes and animal species. Several software packages have been developed for the analysis of neuron tracing results stored in the standard SWC format. However, providing relatively simple quantifications and their non-extendable architecture prohibit their use for advanced data analysis and visualization. We developed nGauge , a Python toolkit to support the parsing and analysis of neuron morphology data. As an application programming interface (API), nGauge can be referenced by other popular open-source software to create custom informatics analysis pipelines and advanced visualizations. nGauge defines an extendable data structure that handles volumetric constructions (e.g. soma), in addition to the SWC linear reconstructions, while remaining light-weight. This greatly extends nGauge’s data compatibility.

Mapping neuroanatomy is a foundational goal towards understanding brain function. Electron microscopy (EM) has been the gold standard for connectivity analysis because nanoscale resolution is necessary to unambiguously resolve chemical and electrical synapses. However, molecular information that specifies cell types is often lost in EM reconstructions. To address this, we devised a light microscopy approach for connectivity analysis of defined cell types called spectral connectomics. We combined multicolor genetic labeling (Brainbow) of neurons with a multi-round immunostaining Expansion Microscopy (miriEx) strategy to simultaneously interrogate morphology, molecular markers, and connectivity in the same brain section. We applied our multimodal profiling strategy to directly link inhibitory neuron cell types with their network morphologies. Furthermore, we showed that correlative Brainbow and endogenous synaptic machinery immunostaining can be used to define putative synaptic connections between spectrally unique neurons, as well as map putative inhibitory and excitatory inputs. We envision that spectral connectomics can be applied routinely in neurobiology labs to gain insights into normal and pathophysiological neuroanatomy across multiple animals and time points.

SUMMARY The Drosophila type-II neuroblast (NB) lineages present an attractive model to investigate the neural differentiation process. With only 16 stem cells, the type-II NB lineages generate many intermediate neural progenitors (INPs) to rapidly expand the neuron and glia pool, similar to those in the human outer subventricular zone (OSVZ). We performed targeted single-cell mRNA sequencing (scRNA-seq) in 3rd instar larval brains and created MiCV, an scRNA-seq data visualization web tool to integrate results from multiple bioinformatics analyses, display co-expression patterns of multiple genes simultaneously, and retrieve gene function and ortholog annotations. We identified novel markers that label distinct neural subsets using MiCV and subsequently in situ profiled them to recover the spatial information lacking in the scRNA-seq data. These new markers further enabled us to build novel neural developmental trajectories that lead to unique neuronal cell fates. Combining prior knowledge, in silico analyses, and in situ evidence, this multi-informatic investigation describes the molecular landscape of neural differentiation from a single developmental snapshot in Drosophila , and provides an experimental and analytical roadmap for navigating the differentiation process of more complex brains.

Identifying the cellular origins and mapping the dendritic and axonal arbors of neurons have been century old quests to understand the heterogeneity among these brain cells. Classical chemical and genetic methods take advantage of light microscopy and sparse labeling to unambiguously, albeit inefficiently, trace a few neuronal lineages or reconstruct their morphologies in each sampled brain. To improve the analysis throughput, we designed Bitbow, a digital format of Brainbow which exponentially expands the color palette to provide tens of thousands of spectrally resolved unique labels. We generated transgenic Bitbow Drosophila lines, established statistical tools, and streamlined sample preparation, image processing and data analysis pipelines to allow conveniently mapping neural lineages, studying neuronal morphology and revealing neural network patterns with an unprecedented speed, scale and resolution.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Summary We are bioinformatics trainees at the University of Michigan who started a local chapter of Girls Who Code to provide a fun and supportive environment for high school women to learn the power of coding. Our goal was to cover basic coding topics and data science concepts through live coding and hands-on practice. However, we could not find a resource that exactly met our needs. Therefore, over the past three years, we have developed a curriculum and instructional format using Jupyter notebooks to effectively teach introductory Python for data science. This method, inspired by The Carpentries organization, uses bite-sized lessons followed by independent practice time to reinforce coding concepts, and culminates in a data science capstone project using real-world data. We believe our open curriculum is a valuable resource to the wider education community and hope that educators will use and improve our lessons, practice problems, and teaching best practices. Anyone can contribute to our educational materials on GitHub.

The ability to reconstruct neuronal networks, local microcircuits, or the entire connectome is a central goal of modern neuroscience. Recently, advancements in sample preparation (e.g., sample expansion and Brainbow labeling) and optical (e.g., confocal and light sheet) techniques have enabled the imaging of increasingly large neural systems with high contrast. Tracing neuronal structures from these images proves challenging, however, necessitating tools that integrate multiple neuronal traces, potentially derived by various methods, into one combined (montaged) result. Here, we present TraceMontage, an ImageJ/Fiji plugin for the combination of multiple neuron traces of a single image, either redundantly or non-redundantly. Internally, it uses graph theory to connect topological patterns in the 3-D spatial coordinates of neuronal trees. The software generates a single output tracing file containing the montage traces of the input tracing files and provides several measures of consistency analysis among multiple tracers. To our knowledge, our software is the first dedicated method for the combination of tracing results. Combining multiple tracers increases the accuracy and speed of tracing of densely-labeled samples by harnessing collaborative effort. This utility is demonstrated using fluorescence microscope images from the hippocampus and primary visual cortex (V1) in Brainbow-labeled mice. TraceMontage provides researchers the ability to combine neuronal tracing data generated by either the same or different method(s). As datasets become larger, the ability to trace images in this parallel manner will help connectomics scale to increasingly larger neural systems.

Summary Characterizing the relationship between neuron spiking and the signals electrodes record is vital to defining the neural circuits driving brain function and informing computational modeling. However, electrode biocompatibility and precisely localizing neurons around the electrodes are critical to defining this relationship. Here, we show the ability to localize post-explant recording tips of subcellular-scale carbon fiber electrodes and surrounding neurons. Immunostaining of astrocyte, microglia, and neuron markers confirmed improved tissue health. While neurons near implants were stretched, their number and distribution were similar to control, suggesting that these minimally invasive electrodes demonstrate the potential to sample naturalistic neural populations. This motivated prediction of the spikes produced by neurons nearest to the electrodes using a model fit with recorded electrophysiology. These simulations show the first direct evidence that neuron placement in the immediate vicinity of the recording site influences how many spike clusters can be reliably identified by spike sorting.