ABSTRACT Seminal plasma exosomes (SPE) have been proposed to regulate intracellular calcium concentration ([Ca 2+ ]i) and sperm function. However, neither the underlying mechanisms by which [Ca 2+ ]i is regulated by SPE nor the physiological and pathological significance of the SPE-evoked calcium signal are fully understood. Here, we successfully isolated and characterized SPE by several methods, including transmission electron microscopy, nanoparticle tracking and nanoflow cytometry analysis. Application of SPE dose-dependently increased human sperm [Ca 2+ ]i via extracellular Ca 2+ influx. The Ca 2+ influx was mediated by the sperm-specific CatSper channel, because the SPE-elevated [Ca 2+ ]i was suppressed by a CatSper inhibitor, and SPE potentiated the CatSper current in human sperm. The role of CatSper in the SPE-induced elevation of [Ca 2+ ]i was further confirmed by the absence of the SPE-induced [Ca 2+ ]i increase and CatSper current in a CatSper-deficient sample. Furthermore, both protein and no-protein components in SPE were shown to contribute to the elevated [Ca 2+ ]i, as well as the hyperactivated motility of human sperm. Interestingly, when sperm were stimulated with exosomes derived from asthenozoospermic semen, the elevation of [Ca 2+ ]i was significantly lower than that by exosomes isolated from normal seminal plasma. The SPE from normal seminal plasma improved the motility of sperm from asthenozoospermic samples. Taken together, these findings demonstrated that SPE modulates Ca 2+ signaling and human sperm function by activating a CatSper channel. The application of SPE to enhance sperm motility may provide a new clinical avenue for asthenozoospermic men.

Abstract Background Accurate and comprehensive annotation of transcript sequences is essential for transcript quantification and differential gene and transcript expression analysis. Single molecule long read sequencing technologies provide improved integrity of transcript structures including alternative splicing, and transcription start and polyadenylation sites. However, accuracy is significantly affected by sequencing errors, mRNA degradation or incomplete cDNA synthesis. Results We present a new and comprehensive Arabidopsis thaliana Reference Transcript Dataset 3 (AtRTD3). AtRTD3 contains over 160k transcripts - twice that of the best current Arabidopsis transcriptome and including over 1,500 novel genes. 79% of transcripts are from Iso-seq with accurately defined splice junctions and transcription start and end sites. We developed novel methods to determine splice junctions and transcription start and end sites accurately. Mis- match profiles around splice junctions provided a powerful feature to distinguish correct splice junctions and remove false splice junctions. Stratified approaches identified high confidence transcription start/end sites and removed fragmentary transcripts due to degradation. AtRTD3 is a major improvement over existing transcriptomes as demonstrated by analysis of an Arabidopsis cold response RNA-seq time-series. AtRTD3 provided higher resolution of transcript expression profiling and identified cold- and light-induced differential transcription start and polyadenylation site usage. Conclusions AtRTD3 is the most comprehensive Arabidopsis transcriptome currently available. It improves the precision of differential gene and transcript expression, differential alternative splicing, and transcription start/end site usage from RNA-seq data. The novel methods for identifying accurate splice junctions and transcription start/end sites are widely applicable and will improve single molecule sequencing analysis from any species.

Abstract Plant disease resistance is a complex process that is maintained in an intricate balance with development. Increasing evidence indicates the importance of post-transcriptional regulation of plant defense by RNA binding proteins. The K homology (KH) repeat is an ancient RNA binding motif found in proteins from diverse organisms. The role of KH domain proteins in pathogen resistance is not well known. From a genetic screen aimed to uncover novel defense genes in Arabidopsis, we identified a new allele of the canonical flowering regulatory gene, FLOWERING LOCUS KH Domain ( FLK ), encoding a putative triple KH-repeat protein. In addition to late flowering, the flk mutants exhibited decreased resistance to the bacterial pathogen Pseudomonas syringae and increased resistance to the necrotrophic fungal pathogen Botrytis cinerea . We found that the flk mutations compromised basal defense and defense signaling mediated by salicylic acid and led to increased reactive oxygen species (ROS) scavenging, likely through FLK ’s regulation of the ROS scavenging enzyme catalases. RNA-seq data revealed that major defense signaling genes are regulated by FLK , providing a molecular basis for FLK ’s contribution to pathogen defense. Together our data support that FLK is a multifunctional protein regulating pathogen defense and development of plants.

We thank the members in the Lu laboratory for their assistance in this work. This work was partially supported by a grant from National Science Foundation (NSF 1456140), UMBC Technology Catalyst Fund, and UMBC CENTRE Funding Initiative to HL.