A safe and durable vaccine is urgently needed to tackle the COVID19 pandemic that has infected >15 million people and caused >620,000 deaths worldwide. As with other respiratory pathogens, the nasal compartment is the first barrier that needs to be breached by the SARS-CoV-2 virus before dissemination to the lung. Despite progress at remarkable speed, current intramuscular vaccines are designed to elicit systemic immunity without conferring mucosal immunity. We report the development of an intranasal subunit vaccine that contains the trimeric or monomeric spike protein and liposomal STING agonist as adjuvant. This vaccine induces systemic neutralizing antibodies, mucosal IgA responses in the lung and nasal compartments, and T-cell responses in the lung of mice. Single-cell RNA-sequencing confirmed the concomitant activation of T and B cell responses in a germinal center-like manner within the nasal-associated lymphoid tissues (NALT), confirming its role as an inductive site that can lead to long-lasting immunity. The ability to elicit immunity in the respiratory tract has can prevent the initial establishment of infection in individuals and prevent disease transmission across humans.

Abstract Respiratory viral infections, especially Influenza (endemic) or SARS-CoV-2 (pandemic since 2020), cause morbidity and mortality worldwide. Despite remarkable progress in the development and deployment of vaccines, they are clearly impacted by the rapid emergence of viral variants. The development of an off-the-shelf, effective, safe, and low-cost drug for prophylaxis against respiratory viral infections is a major unmet medical need. Here, we developed NanoSTING, a liposomally encapsulated formulation of the endogenous STING agonist, 2’-3’ cGAMP, to function as an immunoantiviral. NanoSTING rapidly activates the body’s innate immune system to facilitate a broad-spectrum antiviral response against SARS-CoV-2 and influenza variants in hamsters and mice. We demonstrate that a single intranasal dose of NanoSTING can: (1) treat infections throughout the respiratory system and minimize clinical symptoms, (2) protect against highly pathogenic strains of SARS-CoV-2 (alpha and delta), (3) provide durable protection against reinfection from the same strains without the need for retreatment, (4) prevent transmission of the highly infectious SARS-CoV-2 Omicron strain, and (5) provide protection against both oseltamivir-sensitive and resistant strains of influenza. Mechanistically, administration of NanoSTING rapidly upregulated interferon-stimulated and antiviral pathways in both the nasal turbinates and lung. Our results support using NanoSTING as a thermostable, immunoantiviral with broad-spectrum antiviral properties making it appealing as a therapeutic for prophylactic or early post-exposure treatment.

Abstract Multiple factors in the design of a chimeric antigen receptor (CAR) influence CAR T-cell activity, with costimulatory signals being a key component. Yet, the impact of costimulatory domains on the downstream signaling and subsequent functionality of CAR-engineered natural killer (NK) cells remains largely unexplored. Here, we evaluated the impact of various costimulatory domains on CAR-NK cell activity, using a CD70-targeting CAR. We found that CD28, a costimulatory molecule not inherently present in mature NK cells, significantly enhanced the antitumor efficacy and long-term cytotoxicity of CAR-NK cells both in vitro and in multiple xenograft models of hematologic and solid tumors. Mechanistically, we showed that CD28 linked to CD3Z creates a platform that recruits critical kinases, such as LCK and ZAP70, initiating a signaling cascade that enhances CAR-NK cell function. Our study provides insights into how CD28 costimulation enhances CAR-NK cell function and supports its incorporation in NK-based CARs for cancer immunotherapy.

ABSTRACT The in vivo persistence of adoptively transferred T cells is predictive of anti-tumor response. Identifying functional properties of infused T cells that lead to in vivo persistence and tumor eradication has remained elusive. We profiled CD19-specific CAR T cells that comprise the infusion products used to treat large B cell lymphomas using high-throughput single-cell technologies based on Timelapse Imaging Microscopy In Nanowell Grids (TIMING) that integrates killing, cytokine secretion, and transcriptional profiling. Our results show that the directional migration of CD19-specific CAR T cells is correlated with polyfunctionality. We identified that CD2 on T cells is associated with directional migration and that the interaction between CD2 on T cells and CD58 on lymphoma cells accelerates killing and serial killing. Consistent with this, we observed elevated CD58 expression on pre-treatment tumor samples in patients with relapsed or refractory large B cell lymphomas treated with CD19-specific CAR T cell therapy was associated with complete clinical response and survival. These results highlight the importance of studying dynamic T-cell tumor cell interactions in identifying optimal antitumor responses. KEY POINTS - Profiling patient infusion products revealed that polyfunctional CAR T cells show directional migration, which is associated with higher CD2 expression - The ligand for CD2, CD58 is expressed at higher levels in the tumors of lymphoma patients who respond better to CAR T cell treatment

The oncogenic properties of mutant p53 have been ascribed to destabilization of the p53 conformation, followed by aggregation into insoluble fibrils. Here we combine immunofluorescent 3D confocal microscopy of breast cancer cells expressing the p53 mutant Arg248Gln (R248Q) with light scattering from solutions of the purified protein and molecular simulations to probe the mechanisms that govern phase behaviors of the mutant across multiple length scales, from cellular to molecular. We establish that p53 R248Q forms mesoscopic protein-rich clusters, an anomalous liquid phase with several unique properties. We demonstrate that the clusters host and facilitate the nucleation of amyloid fibrils. The distinct characteristics of the clusters of R248Q and wild-type p53 and theoretical models indicate that p53 condensation into clusters is driven by the structural destabilization of the core domain and not by interactions of its extensive disordered region. Two-step nucleation of mutant p53 amyloids suggests means to control fibrillization and the associated pathologies through modifying the cluster behaviors. In a broader context, our findings exemplify interactions between distinct protein phases that activate complex physicochemical mechanisms operating in biological systems.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) regulate the tumor microenvironment by facilitating transport of biomolecular cargo including RNA, protein, and metabolites. The biological effects of EV-mediated transport have been studied using supra-physiological concentrations of EVs, but the cells that are responsible for EV secretion and the mechanisms that support EV secretion are not well characterized. We developed an integrated method based on arrays of nanowells to identify individual cells with differences in EV secretion and used an automated robot to perform linked single-cell RNA-sequencing on cloned single cells from the metastatic breast cancer cell line, MDAMB231. Gene expression profiles of clonal cells with differences in EV secretion were analyzed, and a four-gene signature of breast cancer EV secretion was identified: HSP90AA1, HSPH1, EIF5 , and DIAPH3 . We functionally validated this gene signature by testing it across different cell lines with different metastatic potential demonstrating that the signature correlated with levels of EV secretion. Analysis of the TCGA and METABRIC datasets showed that this signature is associated with poor survival, more invasive breast cancer types, and reduced CD8 + T cell infiltration in human tumors. We anticipate that our method for directly identifying the molecular determinants of EV secretion will have broad applications across cell types and diseases.

Abstract Engineering cellular therapeutics by programming T cells has great potential in immunology. The primary mechanism employed by T cells for the specific transfer of proteins at the immunological synapse is via the lysosomal perforin pathway that facilitates the transfer of cytotoxic granzymes leading to apoptosis in target cells. Facilitating the delivery of non-cytotoxic proteins through perforin oligomers will dramatically expand the range of protein cargos that T cells can traffic to the target cells. Here, we have identified the intralysosomal protein, NPC2, as a chaperone that can facilitate the delivery of T-cell derived reporter proteins through perforin pores at the immunological synapse. Structural and biophysical considerations suggested that NPC2 could traverse through perforin pores and in vitro experiments confirmed the transport of purified NPC2 through perforin pores on cell membranes. To characterize the ability of NPC2 to facilitate the transfer of payloads in T cells, we constructed NPC2-mCherry fusion proteins in T cells. Using confocal microscopy and flow cytometry, we confirmed the colocalization of the NPC2 fused protein with lytic granules and the transfer of the fluorescent protein payload from T cells to target cells in co-culture experiments. The NPC2 fusion enabled the localization of mCherry to secretory lysosomes in mouse TCR CD8 + T cells and human CD4 + and CD8 + chimeric antigen receptor (CAR) T cells. These results illustrate that by using NPC2 as a molecular chaperone, the NPC2-perforin pathway can be exploited as a programmable molecular delivery system for cell-based therapies.

ABSTRACT Adoptive cell therapy (ACT) based on ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable antitumor responses even in heavily pretreated patients. However, only a subset of patients responds to ACT; efforts to identify correlates of response have focused on profiling the tumor or the TIL but rarely in an interactive environment. Interactive profiling can provide unique insights into the clinical performance of TILs since the fate, function, and metabolism of TILs are influenced by autologous tumor-derived factors. Here, we performed a suite of cell-sparing assays dubbed holistic analysis of the bioactivity of interacting T cells and autologous tumor cells (HABITAT). HABITAT profiling of TILs used for human ACT and their autologous tumor cells included function-based single-cell profiling by timelapse imaging microscopy in nanowell grids (TIMING); multi-omics using RNA-sequencing and proteomics; metabolite inference using genome-scale metabolic modeling, and pulse-chase assays based on confocal microscopy to profile the uptake and fate of fatty acids (FA). Phenotypically, the ACT TILs from both responders (Rs) and nonresponders (NRs) were comprised of predominantly effector memory T cells (T EM cells) and did not express a high frequency of programmed death ligand-1 (PD-L1) and showed no differences in TCR diversity. Our results demonstrate that while tumor cells from both Rs and NRs are efficient at uptaking FAs, R TILs are significantly more efficient at utilizing FA through fatty acid oxidation (FAO) than NR TILs under nutrient starvation conditions. While it is likely that lipid and FA uptake is an inherent adaptation of TIL populations to lipid-rich environments, performing FAO sustains the survival of TILs and allows them to sustain antitumor cytolytic activity. We propose that metabolic plasticity enabling FAO is a desirable attribute of human TILs for ACT leading to clinical responses.

Exosomes mediate intercellular communication in health and disease. Conventional assays are limited in profiling exosomes secreted from large populations of cells and are unsuitable for studying the functional consequences of individual cells exhibiting varying propensity for exosome secretion. In cancer, since exosomes can support the development of the pre-metastatic niche, cells with varying abilities to secrete exosomes can directly impact tumorigenesis. Here, we developed a high throughput single-cell technique that enabled the mapping of exosome secretion dynamics. By utilizing clinically relevant models of breast cancer, we established that non-metastatic cancer cells secrete more exosomes than metastatic cancer cells. Single-cell RNA-sequencing confirmed that pathways related to exosome secretion were enriched in the non-metastatic cells compared to the metastatic cells. We established isogenic clonal cell lines from non-metastatic cells with differing propensities for exosome secretion and showed that exosome secretion is an inheritable property preserved during cell division. Combined in vitro and in vivo studies with these cell lines suggested that exosome secretion can impede tumor formation. In human non-metastatic breast tumors, tumors with higher secretion of exosomes have a better prognosis, higher immune cytolytic activity, and enrichment of pro-inflammatory macrophages compared to tumors with lower secretion of exosomes. Our single-cell methodology can become an essential tool that enables the direct integration of exosome secretion with multiple cellular functions.

Understanding the cellular immune response to infections, cancers and vaccines lags behind the investigation of humoral responses. While neutralizing antibody responses wane over time, the ability of T cells to recognize viruses including SARS-CoV-2 is instrumental to providing long-term immunity. Although T-cell receptor (TCR) repertoire screening can provide insights into the skewing of a T-cell response elicited upon vaccination or infection, they unfortunately provide no assessment into the functional capacity of T cells or their ability to eliminate virally infected targets. We have used time-lapse imaging microscopy in nanowell grids (TIMING) to integrate the migration of individual T cells with analysis of effector functions including cytokine secretion and cytotoxicity. Machine learning is then applied to study thousands of videos of dynamic interactions as T cells with specificity for SARS-CoV-2 eliminate targets bearing spike protein as a surrogate for viral infection. Our data provide the first direct evidence that cytotoxic T lymphocytes from a convalescent patient targeting an epitope conserved across all known variants of concern (VoC) are serial killers capable of eliminating multiple infected targets. These data have implications for development of vaccines to provide broad and sustained cellular immunity and for the recovery and monitoring of individuals who have been exposed to SARS-CoV-2.We present an imaging platform that uses artificial intelligence (AI) to track thousands of individual cell-cell interactions within nanowell arrays. We apply this platform to quantify how the T cell component of adaptive immunity responds to infections. Our results show that T cells specific for a conserved epitope within the SARS-CoV-2 spike protein are serial killers that can rapidly eliminate virally infected targets. The ability to map the functional capacity of T cells and their ability to kill infected cells provides fundamental insights into the immunology of vaccines and recovery from infections.