Camelid single-domain antibody fragments (‘nanobodies’) provide the remarkable specificity of antibodies within a single 15-kDa immunoglobulin VHH domain. This unique feature has enabled applications ranging from use as biochemical tools to therapeutic agents. Nanobodies have emerged as especially useful tools in protein structural biology, facilitating studies of conformationally dynamic proteins such as G-protein-coupled receptors (GPCRs). Nearly all nanobodies available to date have been obtained by animal immunization, a bottleneck restricting many applications of this technology. To solve this problem, we report a fully in vitro platform for nanobody discovery based on yeast surface display. We provide a blueprint for identifying nanobodies, demonstrate the utility of the library by crystallizing a nanobody with its antigen, and most importantly, we utilize the platform to discover conformationally selective nanobodies to two distinct human GPCRs. To facilitate broad deployment of this platform, the library and associated protocols are freely available for nonprofit research. Yeast surface display platform allows nanobody discovery within two to three weeks. Examples include nanobodies for crystallographic applications, targeting nonpurified antigen or conformationally selective nanobodies to two distinct human GPCRs.

The human σ1 receptor is an enigmatic endoplasmic-reticulum-resident transmembrane protein implicated in a variety of disorders including depression, drug addiction, and neuropathic pain. Recently, an additional connection to amyotrophic lateral sclerosis has emerged from studies of human genetics and mouse models. Unlike many transmembrane receptors that belong to large, extensively studied families such as G-protein-coupled receptors or ligand-gated ion channels, the σ1 receptor is an evolutionary isolate with no discernible similarity to any other human protein. Despite its increasingly clear importance in human physiology and disease, the molecular architecture of the σ1 receptor and its regulation by drug-like compounds remain poorly defined. Here we report crystal structures of the human σ1 receptor in complex with two chemically divergent ligands, PD144418 and 4-IBP. The structures reveal a trimeric architecture with a single transmembrane domain in each protomer. The carboxy-terminal domain of the receptor shows an extensive flat, hydrophobic membrane-proximal surface, suggesting an intimate association with the cytosolic surface of the endoplasmic reticulum membrane in cells. This domain includes a cupin-like β-barrel with the ligand-binding site buried at its centre. This large, hydrophobic ligand-binding cavity shows remarkable plasticity in ligand recognition, binding the two ligands in similar positions despite dissimilar chemical structures. Taken together, these results reveal the overall architecture, oligomerization state, and molecular basis for ligand recognition by this important but poorly understood protein.

Abstract Less than a year after its emergence, the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has infected over 22 million people worldwide with a death toll approaching 1 million. Vaccination remains the best hope to ultimately put this pandemic to an end. Here, using Trimer-Tag technology, we produced both wild-type (WT) and furin site mutant (MT) S-Trimers for COVID-19 vaccine studies. Cryo-EM structures of the WT and MT S-Trimers, determined at 3.2 Å and 2.6 Å respectively, revealed that both antigens adopt a tightly closed conformation and their structures are essentially identical to that of the previously solved full-length WT S protein in detergent. These results validate Trimer-Tag as a platform technology in production of metastable WT S-Trimer as a candidate for COVID-19 subunit vaccine.

Abstract Camelid single-domain antibody fragments (“nanobodies”) provide the remarkable specificity of antibodies within a single immunoglobulin V HH domain. This unique feature enables applications ranging from their use as biochemical tools to therapeutic agents. Virtually all nanobodies reported to date have been obtained by animal immunization, a bottleneck restricting many applications of this technology. To solve this problem, we developed a fully in vitro platform for nanobody discovery based on yeast surface display of a synthetic nanobody scaffold. This platform provides a facile and cost-effective method for rapidly isolating nanobodies targeting a diverse range of antigens. We provide a blueprint for identifying nanobodies starting from both purified and non-purified antigens, and in addition, we demonstrate application of the platform to discover rare conformationally-selective nanobodies to a lipid flippase and a G protein-coupled receptor. To facilitate broad deployment of this platform, we have made the library and all associated protocols publicly available.

Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest family of membrane receptors and are the most important drug targets. An agonist-bound GPCR engages heterotrimeric G proteins and triggers the exchange of GDP with GTP to promote G proteins activation. A complete understanding of the molecular mechanisms of G proteins activation has been hindered by a lack of structural information of GPCR-G protein complex in nucleotide-bound states. Here, we present the cryoelectron microscopy (cryo-EM) structures of D1 dopamine receptor (D1R)-G s in the nucleotide-free state, the GDP-bound state and the GTP-bound state with endogenous ligand dopamine. These structures reveal important conformational changes accounting for the release of GDP and the GTP-dependent dissociation of Gα from Gβγ subunits. Combining mutagenesis functional studies, we also identified an important sequence motif in D1R that determines its G protein selectivity. Taken together, these results shed light into the molecular basis of G protein selectivity and the entire molecular signaling events of GPCR-mediated G protein activation.

The peptidoglycan cell wall provides an essential protective barrier in almost all bacteria, defining cellular morphology and conferring resistance to osmotic stress and other environmental hazards. The precursor to peptidoglycan, lipid II, is assembled on the inner leaflet of the plasma membrane. However, peptidoglycan polymerization occurs on the outer face of the plasma membrane, and lipid II must be flipped across the membrane by the MurJ protein prior to its use in peptidoglycan synthesis. Due to its central role in cell wall assembly, MurJ is of fundamental importance in microbial cell biology and is a prime target for novel antibiotic development. However, relatively little is known regarding the mechanisms of MurJ function, and structural data are only available for MurJ from the extremophile Thermosipho africanus. Here, we report the crystal structure of substrate-free MurJ from the Gram-negative model organism Escherichia coli, revealing an inward-open conformation. Taking advantage of the genetic tractability of E. coli, we performed high-throughput mutagenesis and next-generation sequencing to assess mutational tolerance at every amino acid in the protein, providing a detailed functional and structural map for the enzyme and identifying sites for inhibitor development. Finally, through the use of sequence co-evolution analysis we identify functionally important interactions in the outward-open state of the protein, supporting a rocker-switch model for lipid II transport.

Copper (Cu) is a co-factor for several essential metabolic enzymes. Disruption of Cu homeostasis results in genetic diseases such as Wilson's disease. Here, we show that the zinc transporter 1 (ZnT1), known to export zinc (Zn) out of the cell, also mediates Cu2+ entry into cells and is required for Cu2+-induced cell death, cuproptosis. Structural analysis and functional characterization indicate that Cu2+ and Zn2+ share the same primary binding site, allowing Zn2+ to compete for Cu2+ uptake. Among ZnT members, ZnT1 harbors a unique inter-subunit disulfide bond that stabilizes the outward-open conformations of both protomers to facilitate efficient Cu2+ transport. Specific knockout of the ZnT1 gene in the intestinal epithelium caused the loss of Lgr5+ stem cells due to Cu deficiency. ZnT1, therefore, functions as a dual Zn2+ and Cu2+ transporter and potentially serves as a target for using Zn2+ in the treatment of Wilson's disease caused by Cu overload.

Bacteria produce a variety of surface-exposed polysaccharides important for cell integrity, biofilm formation, and evasion of the host immune response. Synthesis of these polymers often involves the assembly of monomer oligosaccharide units on the lipid carrier undecaprenyl-phosphate at the inner face of the cytoplasmic membrane. For many polymers, including cell wall peptidoglycan, the lipid-linked precursors must be transported across the membrane by flippases to facilitate polymerization at the membrane surface. Flippase activity for this class of polysaccharides is most often attributed to MOP (Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide) family proteins. Little is known about how this ubiquitous class of transporters identifies and translocates its cognate precursor over the many different types of lipid-linked oligosaccharides produced by a given bacterial cell. To investigate the specificity determinants of MOP proteins, we selected for variants of the WzxC flippase involved in Escherichia coli capsule (colanic acid) synthesis that can substitute for the essential MurJ MOP-family protein and promote transport of cell wall peptidoglycan precursors. Variants with substitutions predicted to destabilize the inward-open conformation of WzxC lost substrate specificity and supported both capsule and peptidoglycan synthesis. Our results thus suggest that specific substrate recognition by a MOP transporter normally destabilizes the inward-open state, promoting transition to the outward-open conformation and concomitant substrate translocation. Furthermore, the ability of WzxC variants to suppress MurJ inactivation provides strong support for the designation of MurJ as the flippase for peptidoglycan precursors, the identity of which has been controversial.

Abstract Galanin is a biologically active neuropeptide, and functions through three distinct G protein-coupled receptors (GPCRs), namely GALR1, GALR2 and GLAR3. GALR signaling plays important roles in regulating various physiological processes such as energy metabolism, neuropathic pain, epileptic activity, and sleep homeostasis. GALR1 and GALR3 signal through the G i/o pathway, whereas GALR2 signals mainly through the G q/11 pathway. However, the molecular basis for galanin recognition and G protein selectivity of GALRs remains poorly understood. Here, we report the cryoelectron microscopy structures of the GALR1-G o and the GALR2-G q complexes bound to the endogenous ligand galanin or spexin. The galanin peptide mainly adopts an alpha helical structure, which binds at the extracellular vestibule of the receptors, nearly parallel to the membrane plane without penetrating deeply into the receptor core. Structural analysis combined with functional studies reveals important structural determinants for the G protein selectivity of GALRs as well as other class A GPCRs. In addition, we show that the zinc ion is a negative allosteric regulator of GALR1 but not GALR2. Our studies provide insight into the mechanisms of G protein selectivity of GPCRs and highlight potential novel function of the neuromodulator zinc ion as a modulator of GPCR signaling in the central nervous system. Significance Statement Galanin exerts various physiological functions through galanin receptors, including antinociceptive activity, depression and sleep. Here, we reveal a distinct binding site and binding pose of galanin peptide in galanin receptors from that of the published structures of peptide-bound GPCRs. Moreover, our work show that the neuromodulator zinc ion negatively modulates galanin signaling in the central nervous system, and further advances our understanding of mechanisms of G protein selectivity of GPCRs. These unique features of galanin receptors can be exploited for rational design of subtype selective ligands for treatments of neurological disorders.

Assembly of eukaryotic ribosome is a complicated and dynamic process that involves a series of intermediates. How the highly intertwined structure of 60S large ribosomal subunits is established is unknown. Here, we report the structure of an early nucleolar pre-60S ribosome determined by cryo-electron microscopy at 3.7 angstrom resolution, revealing a half assembled subunit. Domains I, II and VI of 25S/5.8S rRNA tightly pack into a native-like substructure, but domains III, IV and V are not assembled. The structure contains 12 assembly factors and 19 ribosomal proteins, many of which are required for early processing of large subunit rRNA. The Brx1-Ebp2 complex would interfere with the assembly of domains IV and V. Rpf1, Mak16, Nsa1 and Rrp1 form a cluster that consolidates the joining of domains I and II. Our structure reveals a key intermediate on the path to the establishment of the global architecture of 60S subunits.