To test the hypothesis that somatic phosphatidylinositol-4,5-bisphospate 3-kinase, catalytic subunit alpha (PIK3CA) mutations would be found in patients with more common disorders including isolated lymphatic malformation (LM) and Klippel-Trenaunay syndrome (KTS).We used next generation sequencing, droplet digital polymerase chain reaction, and single molecule molecular inversion probes to search for somatic PIK3CA mutations in affected tissue from patients seen at Boston Children's Hospital who had an isolated LM (n = 17), KTS (n = 21), fibro-adipose vascular anomaly (n = 8), or congenital lipomatous overgrowth with vascular, epidermal, and skeletal anomalies syndrome (n = 33), the disorder for which we first identified somatic PIK3CA mutations. We also screened 5 of the more common PIK3CA mutations in a second cohort of patients with LM (n = 31) from Seattle Children's Hospital.Most individuals from Boston Children's Hospital who had isolated LM (16/17) or LM as part of a syndrome, such as KTS (19/21), fibro-adipose vascular anomaly (5/8), and congenital lipomatous overgrowth with vascular, epidermal, and skeletal anomalies syndrome (31/33) were somatic mosaic for PIK3CA mutations, with 5 specific PIK3CA mutations accounting for ∼ 80% of cases. Seventy-four percent of patients with LM from Seattle Children's Hospital also were somatic mosaic for 1 of 5 specific PIK3CA mutations. Many affected tissue specimens from both cohorts contained fewer than 10% mutant cells.Somatic PIK3CA mutations are the most common cause of isolated LMs and disorders in which LM is a component feature. Five PIK3CA mutations account for most cases. The search for causal mutations requires sampling of affected tissues and techniques that are capable of detecting low-level somatic mosaicism because the abundance of mutant cells in a malformed tissue can be low.

The incorporation of genomics into medicine is stimulating interest on the return of incidental findings (IFs) from exome and genome sequencing. However, no large-scale study has yet estimated the number of expected actionable findings per individual; therefore, we classified actionable pathogenic single-nucleotide variants in 500 European- and 500 African-descent participants randomly selected from the National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sequencing Project. The 1,000 individuals were screened for variants in 114 genes selected by an expert panel for their association with medically actionable genetic conditions possibly undiagnosed in adults. Among the 1,000 participants, 585 instances of 239 unique variants were identified as disease causing in the Human Gene Mutation Database (HGMD). The primary literature supporting the variants’ pathogenicity was reviewed. Of the identified IFs, only 16 unique autosomal-dominant variants in 17 individuals were assessed to be pathogenic or likely pathogenic, and one participant had two pathogenic variants for an autosomal-recessive disease. Furthermore, one pathogenic and four likely pathogenic variants not listed as disease causing in HGMD were identified. These data can provide an estimate of the frequency (∼3.4% for European descent and ∼1.2% for African descent) of the high-penetrance actionable pathogenic or likely pathogenic variants in adults. The 23 participants with pathogenic or likely pathogenic variants were disproportionately of European (17) versus African (6) descent. The process of classifying these variants underscores the need for a more comprehensive and diverse centralized resource to provide curated information on pathogenicity for clinical use to minimize health disparities in genomic medicine. The incorporation of genomics into medicine is stimulating interest on the return of incidental findings (IFs) from exome and genome sequencing. However, no large-scale study has yet estimated the number of expected actionable findings per individual; therefore, we classified actionable pathogenic single-nucleotide variants in 500 European- and 500 African-descent participants randomly selected from the National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sequencing Project. The 1,000 individuals were screened for variants in 114 genes selected by an expert panel for their association with medically actionable genetic conditions possibly undiagnosed in adults. Among the 1,000 participants, 585 instances of 239 unique variants were identified as disease causing in the Human Gene Mutation Database (HGMD). The primary literature supporting the variants’ pathogenicity was reviewed. Of the identified IFs, only 16 unique autosomal-dominant variants in 17 individuals were assessed to be pathogenic or likely pathogenic, and one participant had two pathogenic variants for an autosomal-recessive disease. Furthermore, one pathogenic and four likely pathogenic variants not listed as disease causing in HGMD were identified. These data can provide an estimate of the frequency (∼3.4% for European descent and ∼1.2% for African descent) of the high-penetrance actionable pathogenic or likely pathogenic variants in adults. The 23 participants with pathogenic or likely pathogenic variants were disproportionately of European (17) versus African (6) descent. The process of classifying these variants underscores the need for a more comprehensive and diverse centralized resource to provide curated information on pathogenicity for clinical use to minimize health disparities in genomic medicine.

Recommendations for laboratories to report incidental findings from genomic tests have stimulated interest in such results. In order to investigate the criteria and processes for assigning the pathogenicity of specific variants and to estimate the frequency of such incidental findings in patients of European and African ancestry, we classified potentially actionable pathogenic single-nucleotide variants (SNVs) in all 4300 European- and 2203 African-ancestry participants sequenced by the NHLBI Exome Sequencing Project (ESP). We considered 112 gene-disease pairs selected by an expert panel as associated with medically actionable genetic disorders that may be undiagnosed in adults. The resulting classifications were compared to classifications from other clinical and research genetic testing laboratories, as well as with in silico pathogenicity scores. Among European-ancestry participants, 30 of 4300 (0.7%) had a pathogenic SNV and six (0.1%) had a disruptive variant that was expected to be pathogenic, whereas 52 (1.2%) had likely pathogenic SNVs. For African-ancestry participants, six of 2203 (0.3%) had a pathogenic SNV and six (0.3%) had an expected pathogenic disruptive variant, whereas 13 (0.6%) had likely pathogenic SNVs. Genomic Evolutionary Rate Profiling mammalian conservation score and the Combined Annotation Dependent Depletion summary score of conservation, substitution, regulation, and other evidence were compared across pathogenicity assignments and appear to have utility in variant classification. This work provides a refined estimate of the burden of adult onset, medically actionable incidental findings expected from exome sequencing, highlights challenges in variant classification, and demonstrates the need for a better curated variant interpretation knowledge base.

Abstract Most human cells contain two non-identical genomes, and differences in their regulation underlie human development and disease. We demonstrate that Fiber-seq Inferred Regulatory Elements (FIREs) enable the accurate quantification of chromatin accessibility across the 6 Gbp diploid human genome with single-molecule and single-nucleotide precision. We find that cells can harbor >1,000 regulatory elements with haplotype-selective chromatin accessibility (HSCA) and show that these elements preferentially localize to genomic loci containing the most human genetic diversity, with the human leukocyte antigen (HLA) locus showing the largest amount of HSCA genome-wide in immune cells. Furthermore, we uncover HSCA elements with sequence non-deterministic chromatin accessibility, representing likely somatic epimutations, and show that productive transcription from the inactive X chromosome is buttressed by clustered promoter-proximal elements that escape X chromosome inactivation.

ABSTRACT BACKGROUND Despite widespread availability of clinical genetic testing, many individuals with suspected genetic conditions do not have a precise diagnosis. This limits their opportunity to take advantage of state-of-the-art treatments. In such instances, testing sometimes reveals difficult-to-evaluate complex structural differences, candidate variants that do not fully explain the phenotype, single pathogenic variants in recessive disorders, or no variants in specific genes of interest. Thus, there is a need for better tools to identify a precise genetic diagnosis in individuals when conventional testing approaches have been exhausted. METHODS Targeted long-read sequencing (T-LRS) was performed on 33 individuals using Read Until on the Oxford Nanopore platform. This method allowed us to computationally target up to 100 Mbp of sequence per experiment, resulting in an average of 20x coverage of target regions, a 500% increase over background. We analyzed patient DNA for pathogenic substitutions, structural variants, and methylation differences using a single data source. RESULTS The effectiveness of T-LRS was validated by detecting all genomic aberrations, including single-nucleotide variants, copy number changes, repeat expansions, and methylation differences, previously identified by prior clinical testing. In 6/7 individuals who had complex structural rearrangements, T-LRS enabled more precise resolution of the mutation, which led, in one case, to a change in clinical management. In nine individuals with suspected Mendelian conditions who lacked a precise genetic diagnosis, T-LRS identified pathogenic or likely pathogenic variants in five and variants of uncertain significance in two others. CONCLUSIONS T-LRS can accurately predict pathogenic copy number variants and triplet repeat expansions, resolve complex rearrangements, and identify single-nucleotide variants not detected by other technologies, including short-read sequencing. T-LRS represents an efficient and cost-effective strategy to evaluate high-priority candidate genes and regions or to further evaluate complex clinical testing results. The application of T-LRS will likely increase the diagnostic rate of rare disorders.

Loss-of-function ABCC8 variants are the commonest cause of congenital hyperinsulinism. On a systematic search of our databases, the p.(Gly111Arg) ABCC8 variant was identified in 26 individuals, of which 23 were from the Indian Agarwal community. Haplotype analysis subsequently confirmed that p.(Gly111Arg) is a founder variant in the Agarwal population. Congenital hyperinsulinism (CHI) usually presents in the newborn period as persistent hypoglycemia due to inappropriate release of insulin from β-cells. Most affected newborns require prolonged hospital stay and are at risk of neurodevelopmental sequelae [1]. The commonest genetic cause of CHI is loss-of-function variants in the ABCC8 gene, encoding the SUR1 subunit of the pancreatic K-ATP channel [1]. ABCC8 is highly polymorphic with founder variants described in the Irish, Finnish, Ashkenazi Jewish, Bedouin, Spanish, and Hispanic populations [2, 3]. In 2013, the p.(Gly111Arg) ABCC8 variant was flagged as a possible founder variant in the Indian population [4]. Subsequently, we observed that this variant contributed disproportionately to the CHI in individuals treated at our center (AIIMS, Delhi), and was present only in patients from the Agarwal community. To investigate this further we searched for individuals with CHI and an ABCC8 p.(Gly111Arg) variant who had presented to AIIMS Delhi within the last 10 years, or had been referred for genetic testing to the Exeter Genomics Laboratory or the Madras Diabetes Research Foundation (MDRF). We identified 26 individuals with a p.(Gly111Arg) variant (n = 9 AIIMS Delhi, n = 15 Exeter, and n = 2 MDRF). Twenty-three children were identified as Agarwals based on their declared community or family name, one patient from the UK, had a surname which translated to "Indian" in Hindi, suggesting north-Indian ancestry; one patient each was Vietnamese and Iranian. The variant was homozygous in 11 individuals, in trans with a second pathogenic ABCC8 variant in 9, and paternally-inherited (consistent with focal disease) in six. Samples from 17 heterozygous parents underwent SNP array analysis (Illumina GSA Arrays "Infinium iSelect 24x1 HTS Custom Beadchip Kit"), which identified a haplotype shared by the 14 parents from the Agarwal community and the one parent with north Indian ancestry, but not the two parents from Vietnam or Iran (Figure 1). Whilst a recombination event within a small region containing ABCC8 could not be excluded, the ethnicity/nationality of these individuals together with descriptions of the p.(Gly111Arg) in non-Indian cohorts suggests it has arisen on multiple alleles over time in different populations. In 5 of the 8 (62.5%) individuals from the Agarwal community with compound heterozygous variants, the second variant was p.(Arg74Gln) (c.221G>A) suggesting that this too may be a founder variant. Further analysis will be needed in corroborating this observation. Agarwals are a large community predominantly residing in the northern, central and western regions of India and are estimated to account for 0.7%–1% of the Indian population [5]. There are 18 clans (gotras) in this community and marriages typically follow the convention of clan exogamy (only taking in the paternal side of the family), and caste endogamy. This practice has led to genetic homogeneity within the community with many founder variants for rare disorders described [5]. This study confirms that p.(Gly111Arg) is a founder variant in the Agarwal community. These results will enable continued monitoring of the variant, allow for rapid prenatal screening for CHI, as well as quick molecular diagnosis in babies with CHI in this community. V.J. conceived the study, collated AIIMS data, and drafted the manuscript. V.R., V.M., and J.J.B. collated genetic data. M.N.W. performed haplotype analysis. S.E.F. interpreted genetic data, co-drafted the manuscript, and acts as the guarantor. We are grateful to Congenital Hyperinsulinism International and Indian Council for Medical Research (no. 57/2/2014-NCD-II) for funding some of the testing at Exeter and MDRF, respectively. Informed consent was obtained from all patients/parents. Ethical approval was obtained from AIIMS Delhi (IEC-109/5.2.21, RP-26/2021) and Genetic Βeta-Cell Research Bank (517/WA/0327). The authors declare no conflicts of interest. The peer review history for this article is available at https://www.webofscience.com/api/gateway/wos/peer-review/10.1111/cge.14657. Restrictions apply to the availability of some data generated or analyzed during this study to preserve patient confidentiality. Access to the genetic data is available only through collaboration to experienced teams working on approved studies examining the mechanisms, cause, diagnosis and treatment of diabetes and other beta cell disorders. Requests for collaboration will be considered by a steering committee following an application to the Genetic Beta Cell Research Bank (https://www.diabetesgenes.org/current-research/genetic-beta-cell-research-bank/).