ABSTRACT BACKGROUND Despite widespread availability of clinical genetic testing, many individuals with suspected genetic conditions do not have a precise diagnosis. This limits their opportunity to take advantage of state-of-the-art treatments. In such instances, testing sometimes reveals difficult-to-evaluate complex structural differences, candidate variants that do not fully explain the phenotype, single pathogenic variants in recessive disorders, or no variants in specific genes of interest. Thus, there is a need for better tools to identify a precise genetic diagnosis in individuals when conventional testing approaches have been exhausted. METHODS Targeted long-read sequencing (T-LRS) was performed on 33 individuals using Read Until on the Oxford Nanopore platform. This method allowed us to computationally target up to 100 Mbp of sequence per experiment, resulting in an average of 20x coverage of target regions, a 500% increase over background. We analyzed patient DNA for pathogenic substitutions, structural variants, and methylation differences using a single data source. RESULTS The effectiveness of T-LRS was validated by detecting all genomic aberrations, including single-nucleotide variants, copy number changes, repeat expansions, and methylation differences, previously identified by prior clinical testing. In 6/7 individuals who had complex structural rearrangements, T-LRS enabled more precise resolution of the mutation, which led, in one case, to a change in clinical management. In nine individuals with suspected Mendelian conditions who lacked a precise genetic diagnosis, T-LRS identified pathogenic or likely pathogenic variants in five and variants of uncertain significance in two others. CONCLUSIONS T-LRS can accurately predict pathogenic copy number variants and triplet repeat expansions, resolve complex rearrangements, and identify single-nucleotide variants not detected by other technologies, including short-read sequencing. T-LRS represents an efficient and cost-effective strategy to evaluate high-priority candidate genes and regions or to further evaluate complex clinical testing results. The application of T-LRS will likely increase the diagnostic rate of rare disorders.

Our report describes clinical, genetic, and biochemical features of participants with a molecularly confirmed congenital disorder of glycosylation (CDG) enrolled in the Frontiers in Congenital Disorders of Glycosylation (FCDGC) Natural History cohort at year 5 of the study.

PurposeTo describe the clinical characteristics, natural history, genetic landscape and phenotypic spectrum of neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL) associated retinal disease.DesignMulticenter retrospective cohort study complemented by a cross-sectional examination.SubjectsTwelve pediatric subjects with biallelic variants in 5 NCL-causing genes (CLN3, CLN6, MFSD8, PPT1, and TPP1).MethodsReview of clinical notes, retinal imaging, electroretinography (ERG), and molecular genetic testing. Two subjects underwent a cross-sectional examination comprising adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy (AOSLO) imaging of the retina and optoretinography (ORG).Main Outcome MeasuresClinical/demographic data, multimodal retinal imaging data, electrophysiology parameters, and molecular genetic testing.ResultsOur cohort included a diverse set of subjects with CLN3-juvenile NCL (n=3), TPP1-late infantile NCL (n=5), PPT1-late infantile or juvenile NCL (n=2), CLN6-infantile NCL (n=1), and CLN7/MFSD8-late infantile NCL (n=1). Five novel pathogenic or likely pathogenic variants were identified. Age at presentation ranged from 2 to 16 years old (mean 7.9 years). Subjects presented with varying phenotypes ranging from severe neurocognitive features (n=8, 67%), including seizures and developmental delays and regressions, to non-syndromic retinal dystrophies (n=2, 17%). Visual acuities at presentation ranged from light perception (LP) to 20/20. In those with recordable ERGs, the traces were electronegative and suggestive of early cone dysfunction. Fundus imaging and OCTs demonstrated outer retinal loss that varied with underlying genotype. High-resolution AO imaging and functional measures with ORG in 2 subjects with atypical TPP1-associated disease revealed significantly different phenotypes of cellular structure and function that could be followed longitudinally.ConclusionsOur cohort data demonstrates that the underlying genetic variants drive the phenotypic diversity in different forms of NCL. Genetic testing can provide molecular diagnosis and ensure appropriate disease management and support for children and their families. With intravitreal enzyme replacement therapy on the horizon as a potential treatment option for NCL-associated retinal degeneration, precise structural and functional measures will be required to more accurately monitor disease progression. We show that adaptive optics imaging and ORG can be used as highly sensitive methods to track early retinal changes which can be used to establish eligibility for future therapies and provide metrics for determining the efficacy of interventions on a cellular scale. To describe the clinical characteristics, natural history, genetic landscape and phenotypic spectrum of neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL) associated retinal disease. Multicenter retrospective cohort study complemented by a cross-sectional examination. Twelve pediatric subjects with biallelic variants in 5 NCL-causing genes (CLN3, CLN6, MFSD8, PPT1, and TPP1). Review of clinical notes, retinal imaging, electroretinography (ERG), and molecular genetic testing. Two subjects underwent a cross-sectional examination comprising adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy (AOSLO) imaging of the retina and optoretinography (ORG). Clinical/demographic data, multimodal retinal imaging data, electrophysiology parameters, and molecular genetic testing. Our cohort included a diverse set of subjects with CLN3-juvenile NCL (n=3), TPP1-late infantile NCL (n=5), PPT1-late infantile or juvenile NCL (n=2), CLN6-infantile NCL (n=1), and CLN7/MFSD8-late infantile NCL (n=1). Five novel pathogenic or likely pathogenic variants were identified. Age at presentation ranged from 2 to 16 years old (mean 7.9 years). Subjects presented with varying phenotypes ranging from severe neurocognitive features (n=8, 67%), including seizures and developmental delays and regressions, to non-syndromic retinal dystrophies (n=2, 17%). Visual acuities at presentation ranged from light perception (LP) to 20/20. In those with recordable ERGs, the traces were electronegative and suggestive of early cone dysfunction. Fundus imaging and OCTs demonstrated outer retinal loss that varied with underlying genotype. High-resolution AO imaging and functional measures with ORG in 2 subjects with atypical TPP1-associated disease revealed significantly different phenotypes of cellular structure and function that could be followed longitudinally. Our cohort data demonstrates that the underlying genetic variants drive the phenotypic diversity in different forms of NCL. Genetic testing can provide molecular diagnosis and ensure appropriate disease management and support for children and their families. With intravitreal enzyme replacement therapy on the horizon as a potential treatment option for NCL-associated retinal degeneration, precise structural and functional measures will be required to more accurately monitor disease progression. We show that adaptive optics imaging and ORG can be used as highly sensitive methods to track early retinal changes which can be used to establish eligibility for future therapies and provide metrics for determining the efficacy of interventions on a cellular scale.