Abstract Custom built microscopes often require control of multiple hardware devices and precise hardware coordination. It is also desirable to have a solution that is scalable to complex systems and translatable between components from different manufacturers. Here we report Python-Microscope, a free and open source Python library for high performance control of arbitrarily complex and scalable custom microscope systems. Python-Microscope offers simple to use Python-based tools, abstracting differences between physical devices by providing a defined interface for different device types. Concrete implementations are provided for a range of specific hardware and a framework exists for further expansion. Python-Microscope supports the distribution of devices over multiple computers while maintaining synchronisation via highly precise hardware triggers. We discuss the architecture choices of Python-Microscope that overcome the performance problems often raised against Python and demonstrate the different use cases that drove its design: its integration in user facing projects, namely in the Microscope-Cockpit project; in controlling complex microscopes at high speed while using the Python programming language; and as a microscope simulation tool for software development.

Abstract Adaptive optics is being applied widely to a range of microscopies in order to improve imaging quality in the presence of specimen-induced aberrations. We present here the first implementation of wavefront-sensorless adaptive optics for a laser-free, aperture correlation, spinning disk microscope. This widefield method provides confocal-like optical sectioning through use of a patterned disk in the illumination and detection paths. Like other high-resolution microscopes, its operation is compromised by aberrations due to refractive index mismatch and variations within the specimen. Correction of such aberrations shows improved signal level, contrast and resolution.

Abstract We have developed “Microscope-Cockpit” (Cockpit), a highly adaptable open source user-friendly Python-based GUI environment for precision control of both simple and elaborate bespoke microscope systems. The user environment allows next-generation near-instantaneous navigation of the entire slide landscape for efficient selection of specimens of interest and automated acquisition without the use of eyepieces. Cockpit uses “Python-Microscope” (Microscope) for high-performance coordinated control of a wide range of hardware devices using open source software. Microscope also controls complex hardware devices such as deformable mirrors for aberration correction and spatial light modulators for structured illumination via abstracted device models. We demonstrate the advantages of the Cockpit platform using several bespoke microscopes, including a simple widefield system and a complex system with adaptive optics and structured illumination. A key strength of Cockpit is its use of Python, which means that any microscope built with Cockpit is ready for future customisation by simply adding new libraries, for example machine learning algorithms to enable automated microscopy decision making while imaging. Highlights User-friendly setup and use for simple to complex bespoke microscopes. Facilitates collaborations between biomedical scientists and microscope technologists. Touchscreen for near-instantaneous navigation of specimen landscape. Uses Python-Microscope, for abstracted open source hardware device control. Well-suited for user training of AI-algorithms for automated microscopy.

We present IsoSense, a wavefront sensing method that mitigates sample dependency in image based sensorless adaptive optics applications in microscopy. Our method employs structured illumination to create additional, high spatial frequencies in the image through custom illumination patterns. This improves the reliability of image quality metric calculations and enables sensorless wavefront measurement even in samples with sparse spatial frequency content. We demonstrate the feasibility of IsoSense for aberration correction in a deformable mirror based structured illumination super-resolution fluorescence microscope.

Imaging of biological matter across resolution scales presents the challenge of preserving the direct and unambiguous correlation of subject features from the macroscopic to the microscopic level. We present here a correlative imaging platform developed specifically for imaging cells in 3D, under cryogenic conditions. Rapid cryo-preservation of biological specimens is the current gold standard in sample preparation for ultrastructural analysis in X-ray imaging. However, cryogenic fluorescence localisation methods are by and large diffraction-limited and fail to deliver matching resolution. We addressed this technological gap by developing an integrated, user-friendly, platform for 3D correlative imaging of cells in cryo-preserved states using super-resolution structured illumination microscopy (SIM) in conjunction with soft X-ray tomography (SXT). The power of this new approach is demonstrated by studying the process of reovirus release from intracellular vesicles during the early stages of infection and identifying novel virus-induced structures.

Abstract 3D structured illumination microscopy (3D-SIM) doubles the resolution of fluorescence imaging in lateral and axial directions and increases contrast in both fixed and live specimens. However, 3D-SIM has so far not been widely applied to imaging deep in thick tissues due to its sensitivity to specimen-induced aberrations, making the method difficult to apply beyond 10 µm in depth. Furthermore, 3D-SIM has not been available in an upright configuration, limiting its use for live imaging while manipulating the specimen, for example with electrophysiology. Here, we have overcome these barriers by developing a novel upright 3D-SIM system (termed Deep3DSIM) that incorporates adaptive optics (AO) for aberration correction and remote focusing, reducing artefacts, and removing the need to move the specimen or objective. Both these advantages are equally applicable to inverted 3D-SIM microscopes. We demonstrate high-quality 3D-SIM imaging up to 130 µm into complex tissue and live sample manipulation, including human cells and Drosophila larval brains and embryos.

Rapid cryo-preservation of biological specimens is the gold standard for ultra-structural analysis. However, current methods for fluorescence imaging molecules under cryogenic conditions are limited to low resolutions of 400 nm. We have developed CryoSIM, a microscope for 3D super-resolution fluorescence cryo-imaging at 200 nm resolution using structured illumination microscopy. CryoSIM dramatically increases the usefulness of correlative imaging with cryo electron microscopy or cryo soft X-ray tomography by reducing the resolution gap. The microscope is easily reproducible, as it is assembled from commodity parts and controlled by the open source Python Microscope and Cockpit software.