Summary Agro‐infiltration of leaf tissue with binary vectors harbouring a sequence of interest is a rapid method of expressing proteins in plants. It has recently been shown that flanking the sequence to be expressed with a modified 5′‐untranslated region (UTR) and the 3′‐UTR from Cowpea mosaic virus (CPMV) RNA‐2 (CPMV‐ HT ) within the binary vector pBINPLUS greatly enhances the level of expression that can be achieved [ Sainsbury, F. and Lomonossoff, G.P. (2008) Plant Physiol . 148 , 1212–1218]. To exploit this finding, a series of small binary vectors tailored for transient expression (termed the pEAQ vectors) has been created. In these, more than 7 kb of non‐essential sequence was removed from the pBINPLUS backbone and T‐DNA region, and unique restriction sites were introduced to allow for accommodation of multiple expression cassettes, including that for a suppressor of silencing, on the same plasmid. These vectors allow the high‐level simultaneous expression of multiple polypeptides from a single plasmid within a few days. Furthermore, vectors have been developed which allow the direct cloning of genes into the binary plasmid by both restriction enzyme‐based cloning and GATEWAY recombination. In both cases, N‐ or C‐terminal histidine tags may be fused to the target sequence as required. These vectors provide an easy and quick tool for the production of milligram quantities of recombinant proteins from plants with standard plant research techniques at a bench‐top scale.

Abstract Plant-based overexpression of heterologous proteins has attracted much interest and development in recent years. To date, the most efficient vectors have been based on RNA virus-derived replicons. A system based on a disabled version of cowpea mosaic virus RNA-2 has been developed, which overcomes limitations on insert size and introduces biocontainment. This system involves positioning a gene of interest between the 5′ leader sequence and 3′ untranslated region (UTR) of RNA-2, thereby emulating a presumably stable mRNA for efficient translation. Thus far, the sequence of the 5′ UTR has been preserved to maintain the ability of the modified RNA-2 to be replicated by RNA-1. However, high-level expression may be achieved in the absence of RNA-1-derived replication functions using Agrobacterium-mediated transient transformation. To investigate those features of the 5′ UTR necessary for efficient expression, we have addressed the role of two AUG codons found within the 5′ leader sequence upstream of the main initiation start site. Deletion of an in-frame start codon upstream of the main translation initiation site led to a massive increase in foreign protein accumulation. By 6 d postinfiltration, a number of unrelated proteins, including a full-size IgG and a self-assembling virus-like particle, were expressed to >10% and 20% of total extractable protein, respectively. Thus, this system provides an ideal vehicle for high-level expression that does not rely on viral replication of transcripts.

In 1853, the perception of prostate cancer (PCa) as a rare ailment prevailed, was described by the eminent Londoner surgeon John Adams.Rapidly forward to 2018, the landscape dramatically altered.Currently, men face a one-in-nine lifetime risk of PCa, accentuated by improved diagnostic methods and an ageing population.With more than three million men in the United States alone grappling with this disease, the overall risk of succumbing to stands at one in 39.The intricate clinical and biological diversity of PCa poses serious challenges in terms of imaging, ongoing monitoring, and disease management.In the field of theranostics, diagnostic and therapeutic approaches that harmoniously merge targeted imaging with treatments are integrated.A pivotal player in this arena is radiotheranostics, employing radionuclides for both imaging and therapy, with prostate-specific membrane antigen (PSMA) at the forefront.Clinical milestones have been reached, including FDA-and/or EMA-approved PSMA-targeted radiodiagnostic agents, such as [ 18 F]DCFPyL (PYLARIFY ® , Lantheus Holdings), [ 18 F]rhPSMA-7.3(POSLUMA ® , Blue Earth Diagnostics) and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 (Locametz ® , Novartis/ ILLUCCIX ® , Telix Pharmaceuticals), as well as PSMA-targeted radiotherapeutic agents, such as [ 177 Lu]Lu-PSMA-617 (Pluvicto ® , Novartis).Concurrently, ligand-drug and immune therapies designed to target PSMA are being advanced through rigorous preclinical research and clinical trials.This review delves into the annals of PSMA-targeted radiotheranostics, exploring its historical evolution as a signature molecule in PCa management.We scrutinise its clinical ramifications, acknowledge its limitations, and peer into the avenues that need further exploration.In the crucible of scientific inquiry, we aim to illuminate the path toward a future where the enigma of PCa is deciphered and where its menace is met with precise and effective countermeasures.In the following sections, we discuss the intriguing terrain of PCa radiotheranostics through the lens of PSMA, with the fervent hope of advancing our understanding and enhancing clinical practice.

ABSTRACT The end-to-end fusion of enzymes that catalyse successive steps in a reaction pathway is a metabolic engineering strategy that has been successfully applied in a variety of pathways and is particularly common in terpene bioproduction. Despite its popularity, limited work has been done to interrogate the mechanism of metabolic enhancement from enzyme fusion. We observed a remarkable >110-fold improvement in nerolidol production upon translational fusion of nerolidol synthase (a sesquiterpene synthase) to farnesyl diphosphate synthase. This delivered a titre increase from 29.6 mg/L up to 4.2 g/L nerolidol in a single engineering step. Whole-cell proteomic analysis revealed that nerolidol synthase levels in the fusion strains were greatly elevated compared to the non-fusion control. Similarly, the fusion of nerolidol synthase to non-catalytic domains also produced comparable increases in titre, which coincided with improved enzyme expression. When farnesyl diphosphate synthase was fused to other terpene synthases, we observed more modest improvements in terpene titre (1.9- and 3.8-fold), which corresponds to increases of a similar magnitude in terpene synthase expression. Therefore, increased in vivo enzyme levels – resulting from improved expression and/or stability – is likely to be a major driver of catalytic enhancement from enzyme fusion.

ABSTRACT Enzyme spatial organisation and compartmentalisation are naturally evolved mechanisms for facilitating multi-step biocatalysis. We explored the synthetic in vivo co-encapsulation of two different cargo proteins in yeast using a self-assembling virus-like particle. Co-encapsulation was verified using single particle techniques for both end-to-end fusion of the cargo proteins with the encapsulation anchor at one end, and coexpression of each cargo protein with their individual anchors. The co-encapsulation of a bifunctional geranyl diphosphate/farnesyl diphosphate synthase and a bifunctional linalool/nerolidol synthase delivered nerolidol titres up to 30 times that of an unorganised ‘free’ enzyme control, a remarkable improvement from a single engineering step. Interestingly, striking differences in the ratio of products (linalool and nerolidol) were observed with each spatial organisation approach. This work presents the largest reported titre fold increases from in vivo enzyme compartmentalisation and suggests that enzyme spatial organisation could be used to modulate the product profile of promiscuous enzymes.

ABSTRACT Metabolic pathways are commonly organised by sequestration into discrete cellular compartments. Compartments prevent unfavourable interactions with other pathways and provide local environments conducive to the activity of encapsulated enzymes. Such compartments are also useful synthetic biology tools for examining enzyme/pathway behaviour and for metabolic engineering. Here, we expand the intracellular compartmentalisation toolbox for budding yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) with engineered Murine polyomavirus virus-like particles (MPyV VLPs). The MPyV system has two components: VP1 which self-assembles into the compartment shell; and a short anchor, VP2C, which mediates cargo protein encapsulation via binding to the inner surface of the VP1 shell. Destabilised GFP fused to VP2C was specifically sorted into VLPs and thereby protected from host-mediated degradation. In order to access metabolites of native and engineered yeast metabolism, VLP-based nanocompartments were directed to assemble in the cytosol by removal of the VP1 nuclear localisation signal. To demonstrate their ability to function as a metabolic compartment, MPyV VLPs were used to encapsulate myo-inositol oxygenase (MIOX), an unstable and rate-limiting enzyme in D-glucaric acid biosynthesis. Strains with encapsulated MIOX produced ~20% more D-glucaric acid compared to controls expressing ‘free’ MIOX - despite accumulating dramatically less expressed protein - and also grew to higher cell densities. These effects were linked to enzyme stabilisation and mitigation of cellular toxicity by the engineered compartment. This is the first demonstration in yeast of an artificial biocatalytic compartment that can participate in a metabolic pathway and establishes the MPyV platform as a promising synthetic biology tool for yeast engineering.

Abstract Protein cages are attractive as molecular scaffolds for the fundamental study of enzymes and metabolons, and for the creation of biocatalytic nanoreactors for in vitro and in vivo use. Virus-like particles (VLPs) such as those derived from the P22 bacteriophage capsid protein make versatile self-assembling protein cages and can be used to encapsulate a broad range of protein cargos. In vivo encapsulation of enzymes within VLPs requires fusion to the coat protein or a scaffold protein. However, the expression level, stability and activity of cargo proteins can vary upon fusion. Moreover, it has been shown that molecular crowding of enzymes inside virus-like particles can affect their catalytic properties. Consequently, testing of numerous parameters is required for production of the most efficient nanoreactor for a given cargo enzyme. Here we present a set of acceptor vectors that provide a quick and efficient way to build, test and optimise cargo loading inside P22 virus-like particles. We prototyped the system using yellow fluorescent protein then applied it to mevalonate kinases, a key enzyme class in the industrially important terpene (isoprenoid) synthesis pathway. Different mevalonate kinases required considerably different approaches to deliver maximal encapsulation as well as optimal kinetic parameters, demonstrating the value of being able to rapidly access a variety of encapsulation strategies. The vector system described here provides an approach to optimise cargo enzyme behaviour in bespoke P22 nanoreactors. This will facilitate industrial applications as well as basic research on nanoreactor-cargo behaviour. Abstract Figure

Bacterial cell factories have been successfully engineered to efficiently assemble spherical polyhydroxybutyrate inclusions coated with functional proteins of interest. In these submicrometer-sized core-shell assemblies, proteins are bioconjugated to the polymer core, enabling bioengineering for uses as bioseparation resins, enzyme carriers, diagnostic reagents, and particulate vaccines. Here, we explore whether these functional protein-polymer assemblies could be restructured via dissolution and subsequent precipitation while retaining the functionality of the conjugated protein. Polymer core-protein shell assemblies were completely dissolved in chloroform. Subsequent reconstitution into different formats such as hollow spheres, fibers, and films was achieved. Different proteins such as the green fluorescent protein or IgG binding domains GB1 or Z derived from protein G or protein A, respectively, were implemented to monitor the retention of protein function upon generation of reformatted materials. Materials were characterized and the retention of protein functionality was studied by assessing the fluorescence or IgG binding capacity. Since the Z domain protein functionality is retained, it suggests that protein refolding properties are critical parameters for restructuring these functional materials. This study shows that bioengineered biologically assembled protein-coated biopolymer particles can be completely dissolved and reformed into fibers, films, and hollow spheres retaining the original protein function.

SUMMARY Persistent plant viruses may be the most common viruses in wild plants. A growing body of evidence for mutualism between such viruses and their hosts, suggests that they play an important role in ecology and agriculture. Here we present the structure of a plant-specific partitivirus capsid at 2.9 Å resolution by Cryo-EM. Structural features, including the T =1 arrangement of 60 coat protein dimers, are shared with fungal partitiviruses and the picobirnavirus lineage of dsRNA viruses. However, the topology of the capsid is markedly different with protrusions emanating from, and partly comprising, the binding interface of coat protein dimers. We show that a disordered region at the apex of the protrusion is not required for capsid assembly and represents a hypervariable site characteristic of the plant-specific partitiviruses. These results suggest a structural basis for the acquisition of additional functions by partitivirus coat proteins that enables mutualistic relationships with diverse plant hosts.

Abstract Protein cages are a common architectural motif used by living organisms to compartmentalize and control biochemical reactions. While engineered protein cages have recently been featured in the construction of nanoreactors and synthetic organelles, relatively little is known about the underlying molecular parameters that govern cage stability and molecular flux through their pores. In this work, we systematically designed a 24-member library of protein cage variants based on the T. maritima encapsulin, each featuring pores of different size and charge. Twelve encapsulin pore variants were successfully assembled and purified, including eight designs with exceptional and prolonged thermal stability. While pores lined with negatively charged residues resulted in more robust assemblies than their corresponding positively charged variants, we were able to form stable assemblies covering a full range of pore sizes and charges, as observed in seven new cryo-EM structures of pore variants elucidated at resolutions between 2.5-3.6 Å. Alongside these structures, molecular dynamics simulations and stopped flow kinetics experiments reveal the importance of considering both pore size and surface charge, together with flexibility and rate determining steps, when designing protein cages for controlling molecular flux. Abstract Figure