Abstract Tilapia lake virus (TiLV) is a recently described virus affecting wild and farmed tilapines. At present, it has been reported on three continents (Asia, Africa and South America) and the number of countries where the agent has been detected is likely to increase rapidly as a result of increased awareness, surveillance and availability of diagnostic methods. Any lack of openness regarding the TiLV status of a translocating live tilapia population destined for aquaculture may inadvertently contribute to the spread of the agent. Currently, there is no cure for viral diseases in aquaculture and while vaccines and selective breeding have proved successful in reducing the severity of some viral diseases, there are currently severe knowledge gaps relating to TiLV and no effective, affordable vaccines are yet available. This paper summarizes the published scientific information on TiLV and highlights important issues relating to its diagnosis, mitigation and control measures. While there have been no scientific studies on the socio‐economic impact of TiLV, it may pose a significant threat particularly to small‐scale fish farmers’ livelihoods and wild tilapine populations if left uncontrolled. To aid disease investigations, the authors propose case definitions for suspected and confirmed cases of TiLV infections.

Abstract Tilapia tilapinevirus (also known as tilapia lake virus, TiLV) is an important virus responsible for die-off of farmed tilapia globally. Detection and quantification of the virus from environmental DNA/RNA (eDNA/eRNA) using pond water represents a potential, noninvasive routine approach for pathogen monitoring and early disease forecasting in aquaculture systems. Here, we report a simple iron flocculation method for viral concentration from water combined with a newly developed hydrolysis probe quantitative RT-qPCR method for detection and quantification of TiLV. The RT-qPCR method targeting a conserved region of TiLV genome segment 9 has a detection limit of 10 viral copies per µL of template. The method had a 100% analytical specificity and sensitivity for TiLV. The optimized iron flocculation method was able to recover 16.11 ± 3.3% of virus from water samples spiked with viral cultures. During disease outbreak cases from an open-caged system and a closed hatchery system, both tilapia and water samples were collected for detection and quantification of TiLV. The results revealed that TiLV was detected from both clinically sick fish and asymptomatic fish. Most importantly, the virus was successfully detected from water samples collected from different locations in the affected farms e.g. river water samples from affected cages (8.50 × 10 2 to 2.79 × 10 4 copies/L) and fish-rearing water samples, sewage, and reservoir (4.29 × 10 2 to 3.53 × 10 3 copies/L) from affected and unaffected ponds of the hatchery. In summary, this study suggests that the eRNA detection system using iron flocculation coupled with probe based-RT-qPCR is feasible for concentration and quantification of TiLV from water. This approach might be useful for noninvasive monitoring of TiLV in tilapia aquaculture systems and facilitating appropriate decisions on biosecurity interventions needed.

Abstract Infectious diseases represent one of the major challenges to sustainable aquaculture production. Rapid, accurate diagnosis and genotyping of emerging pathogens during early-suspected disease cases is critical to facilitate timely response to deploy adequate control measures and prevent or reduce spread. Currently, most laboratories use PCR to amplify partial pathogen genomic regions, occasionally combined with sequencing of PCR amplicon(s) using conventional Sanger sequencing services for confirmatory diagnosis. The main limitation of this approach is the lengthy turnaround time. Here, we report an innovative approach using a previously developed specific PCR assay for pathogen diagnosis combined with a new Oxford Nanopore Technologies (ONT)-based amplicon sequencing method for pathogen genotyping. Using fish clinical samples, we applied this approach for the rapid confirmation of PCR amplicon sequences identity and genotyping of tilapia lake virus (TiLV), a disease-causing virus affecting tilapia aquaculture globally. The consensus sequences obtained after polishing exhibit strikingly high identity to references derived by Illumina and Sanger methods (99.83-100%). This study suggests that ONT-based amplicon sequencing is a promising platform to deploy in regional aquatic animal health diagnostic laboratories in low and medium income countries, for fast identification and genotyping of emerging infectious pathogens from field samples within a single day.

Abstract Intensification of fish farming practices is being driven by the demand for increased food production to support a rapidly growing global human population, particularly in lower-middle income countries. Intensification of production, however, increases the risk of disease outbreaks and thus the likelihood for crop losses. The microbial communities that colonise the skin mucosal surface of fish are poorly understood, but are important in maintaining fish health and resistance against disease. This skin microbial community is susceptible to disruption through stressors associated with transport, handling and the environment of intensive practices, and this risks the propagation of disease-causing pathogens. In this study, we characterised the microbial assemblages found on tilapia skin — the most widely farmed finfish globally — and in the surrounding water of seven earthen aquaculture ponds from two pond systems in distinct geographic regions in Malawi. Metabarcoding approaches were used to sequence the prokaryotic and microeukaryotic communities. We found 92% of prokaryotic amplicon sequence variants were common to both skin and water samples. Differentially enriched and core taxa, however, differed between the skin and water samples. In tilapia skin, Cetobacterium, Paucibacter, Pseudomonas and Comamonadaceae were enriched, whereas, the cyanobacteria Cyanobium, Microcystis and/or Synechocystis , and the diatom Cyclotella , were most prevalent in pond water. Ponds that clustered together according to their water prokaryotic communities also had similar microeukaryotic communities indicating strong environmental influences on prokaryotic and microeukaryotic community structures. While strong site-specific clustering was observed in pond water, the grouping of tilapia skin prokaryotes by pond site was less distinct, suggesting fish microbiota have a greater buffering capacity against environmental influences. The characterised diversity, structure and variance of microbial communities associated with tilapia culture in Malawi provide the baseline for studies on how future intensification practices may lead to microbial dysbiosis and disease onset. Highlights Fish skin and pond water communities differ structurally, but share common taxa Pond locations have a stronger influence on water versus fish skin microbiome community structure Selected skin-associated taxa could be used to monitor dysbiotic events in aquaculture Taxa with opportunistic pathogen potential were identified at low abundance

Abstract Tilapia aquaculture faces significant threats posed by four prominent pathogens: tilapia lake virus (TiLV), infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV), Francisella orientalis , and Streptococcus agalactiae . Currently, employed molecular diagnostic methods for these pathogens rely on multiple singleplex PCR reactions, which are both time-consuming and expensive. In this study, we present a pioneering approach utilizing a novel multiplex PCR (mPCR) assay, coupled with rapid Nanopore sequencing, enabling for the one-tube simultaneous detection and one-reaction Nanopore sequencing-based identification of all four pathogens. Our one-tube multiplex assay exhibits a detection limit of 1,000 copies per reaction for TiLV, ISKNV, and S. agalactiae , while for F. orientalis , the detection limit is 10,000 copies per reaction. This capability allows for the detection of single infections as well as co-infections in clinical samples within a single day. Moreover, the consensus sequences generated from the amplicons of each sample demonstrate 100% sequence identity with publicly available data, providing strong support for the improving accuracy of Nanopore sequencing. The integration of multiplex PCR and Nanopore sequencing provides a promising and cost-effective platform for rapid and precise diagnostics of major tilapia pathogens, making it a valuable tool for enhancing health management practices within the aquaculture industry, ultimately contributing to improved disease control and prevention.

Introduction Aquatic foods, particularly fish, are essential for addressing malnutrition, especially in vulnerable populations like children and women. In India, traditional aquaculture practices centered around carp species often overlooked the production of nutrient-rich small fish. To address this, nutrition-sensitive aquaculture approaches advocate for integrating species like mola carplet ( Amblypharyngodon mola ) rich in micronutrients, into existing systems. In Odisha, India, where poverty and food insecurity are prevalent, the government initiated a program to empower women through aquaculture, focusing on nutrition-sensitive carp-mola polyculture in community ponds through Women Self-Help Groups (WSHGs). Methods This study evaluates the effectiveness of this government program in enhancing income, household nutrition, and women’s empowerment. Data from field surveys conducted across all 30 districts of Odisha were analyzed to assess participation, capacity building, adoption of better management practices (BMPs), productivity of carp-mola polyculture, household fish consumption, and profitability. Results and discussion The study found widespread participation and adoption of BMPs among WSHGs, leading to increased productivity and income. Carp-mola polyculture systems showed higher productivity and consumption rates, contributing to improved nutrition among WSHGs and their communities. Despite challenges such as input costs and limited mola availability, WSHGs reported profitability from fish farming, with carp-mola polyculture systems yielding higher net income. Factors influencing productivity and profitability included water retention period, stocking density, feed application, and training. The program’s impact extended beyond economic benefits, encompassing environmental improvement, women’s empowerment, and enhanced nutrition outcomes. The study highlights the success of the government program in promoting sustainable aquaculture practices and improving nutrition outcomes in Odisha. Continued support, capacity building, and collaboration among stakeholders are essential for scaling up nutrition-sensitive aquaculture interventions and ensuring long-term sustainability. Strengthening dissemination processes, addressing challenges, and further research on small indigenous fish production techniques are crucial for maximizing the program’s impact on food security and rural development.

The gene of RNA viruses, encoding RNA-directed RNA polymerase (RdRp) is relatively conserved due to its crucial function in viral genome replication and transcription making it a useful target for genetic diversity study and PCR detection. In this study, we investigated the genetic diversity of 21 tilapia lake virus (TiLV) genome segment 1 sequences predictively coding for RdRp subunit P1. Those sequences were obtained from infected fish samples collected in Ecuador, Israel, Peru, and Thailand between 2011 and 2019 (nine sequences from this study and 12 sequences from GenBank). Primers were then designed from the highly conserved regions among all 21 TiLV segment 1 sequences and used in semi-nested RT-PCR condition optimization. The result revealed that all 21 TiLV segment 1 sequences showed 95.00-99.94 and 99.00-100% nucleotide and amino acid sequence identity, respectively. These isolates were phylogenically clustered into three separate genetic clades, called i) Israeli-2011 clade (containing of TiLV isolates from Israel collected in 2011, Ecuador, and Peru isolates), ii) monophyletic Israel-2012 clade (containing only TiLV isolates collected from Israel in 2012), and iii) Thai clade (containing only sequences obtained from Thailand isolates). The newly established PCR protocol was 100 times more sensitive than our previous segment 3-based protocol when comparatively assayed with RNA extracted from infected fish. The assay was also shown to be specific when tested against negative control samples, i.e. RNA extracted from clinical healthy tilapia and from bacterial and viral pathogens (other than TiLV) commonly found in aquatic animals. Validation experiment with RNA extracted from naturally infected fish specimens collected in 2013-2019 yielded positive test results for all samples tested, confirming that our newly designed primers and detection protocol against TiLV segment 1, have a potential application for detection of all current genetic variants of TiLV.

ABSTRACT Tilapia lake virus (TiLV) is a highly contagious viral pathogen that affects tilapia, a globally significant and affordable source of fish protein. To prevent the introduction and spread of TiLV and its impact, there is an urgent need for increased surveillance, improved biosecurity measures, and continuous development of effective diagnostic and rapid sequencing methods. In this study, we have developed a multiplexed RT-PCR assay that can amplify all ten complete genomic segments of TiLV from various sources of isolation. The amplicons generated using this approach were immediately subjected to real-time sequencing on the Nanopore system. By using this approach, we have recovered and assembled 10 TiLV genomes from total RNA extracted from naturally TiLV-infected tilapia fish, concentrated tilapia rearing water, and cell culture. Our phylogenetic analysis, consisting of more than 36 TiLV genomes from both newly sequenced and publicly available TiLV genomes, provides new insights into the high genetic diversity of TiLV. This work is an essential steppingstone towards integrating rapid and real-time Nanopore-based amplicon sequencing into routine genomic surveillance of TiLV, as well as future vaccine development.

1 Abstract Mass mortalities of the larval stage of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii , have been occurring in Bangladesh since 2011. Mortalities can reach 100% and have resulted in an 80% decline in the number of hatcheries actively producing M. rosenbergii . To investigate a causative agent for the mortalities, a disease challenge was carried out using infected material from a hatchery experiencing mortalities. Moribund larvae from the challenge were prepared for metatranscriptomic sequencing. De novo virus assembly revealed a 29 kb single-stranded positive-sense RNA virus with similarities in key protein motif sequences to yellow head virus (YHV), an RNA virus that causes mass mortalities in marine shrimp aquaculture, and other viruses in the Nidovirales order. Primers were designed against the novel virus and used to screen cDNA from larvae sampled from hatcheries in the South of Bangladesh from two consecutive years. Larvae from all hatcheries screened from both years were positive by PCR for the novel virus, including larvae from a hatchery that at the point of sampling appeared healthy, but later experienced mortalities. These screens suggest that the virus is widespread in M. rosenbergii hatchery culture in southern Bangladesh, and that early detection of the virus can be achieved by PCR. The hypothesised protein motifs of MrGV suggest that it is likely to be a new species within the Nidovirales order. Biosecurity measures should be taken in order to mitigate global spread through the movement of post-larvae within and between countries, which has previously been linked to other virus outbreaks in crustacean aquaculture.