Summary

 Spermatogenesis requires intricate interactions between the germline and somatic cells. Within a given cross section of a seminiferous tubule, multiple germ and somatic cell types co-occur. This cellular heterogeneity has made it difficult to profile distinct cell types at different stages of development. To address this challenge, we collected single-cell RNA sequencing data from ∼35,000 cells from the adult mouse testis and identified all known germ and somatic cells, as well as two unexpected somatic cell types. Our analysis revealed a continuous developmental trajectory of germ cells from spermatogonia to spermatids and identified candidate transcriptional regulators at several transition points during differentiation. Focused analyses delineated four subtypes of spermatogonia and nine subtypes of Sertoli cells; the latter linked to histologically defined developmental stages over the seminiferous epithelial cycle. Overall, this high-resolution cellular atlas represents a community resource and foundation of knowledge to study germ cell development and in vivo gametogenesis.

Summary Conventional dogma presumes that protamine-mediated DNA compaction in sperm is achieved by passive electrostatics between DNA and the arginine-rich core of protamines. However, phylogenetic analysis reveals several non-arginine residues that are conserved within, but not across, species. The functional significance of these residues or post-translational modifications are poorly understood. Here, we investigated the functional role of K49, a rodent-specific lysine residue in mouse protamine 1 (P1) that is acetylated early in spermiogenesis and retained in sperm. In vivo , an alanine substitution (P1 K49A) results in ectopic histone retention, decreased sperm motility, decreased male fertility, and in zygotes, premature P1 removal from paternal chromatin. In vitro , the P1 K49A substitution decreases protamine-DNA binding and alters DNA compaction/decompaction kinetics. Hence, a single amino acid substitution outside the P1 arginine core is sufficient to profoundly alter protein function and developmental outcomes, suggesting that protamine non-arginine residues are essential to ensure reproductive fitness.

Summary Testicular development and function relies on interactions between somatic cells and the germline, but similar to other organs, regenerative capacity decline in aging and disease. Whether the adult testis maintains a reserve progenitor population with repair or regenerative capacity remains uncertain. Here, we characterized a recently identified mouse testis interstitial population expressing the transcription factor Tcf21. We found that Tcf21 + cells are bipotential somatic progenitors present in fetal testis and ovary, maintain adult testis homeostasis during aging, and act as reserve somatic progenitors following injury. In vitro , Tcf21 + cells are multipotent mesenchymal progenitors which form multiple somatic lineages including Leydig and myoid cells. Additionally, Tcf21 + cells resemble resident fibroblast populations reported in other organs having roles in tissue homeostasis, fibrosis, and regeneration. Our findings reveal that the testis, like other organs, maintains multipotent mesenchymal progenitors that can be leveraged in development of future therapies for hypoandrogenism and/or infertility. Highlights Multipotent Tcf21 + MPs can differentiate into somatic testis cell types Tcf21 + cells contribute to testis and ovary somatic cells during gonadal development Tcf21 + cells replenish somatic cells of the aging testis and in response to tissue injury Testis Tcf21 cells resemble resident fibroblast populations in multiple organs

Abstract There is a well-established link between abnormal sperm chromatin states and poor motility, however, how these two processes are interdependent is unknown. Here, we identified a possible mechanistic insight by showing that Protamine 2, a nuclear DNA packaging protein in sperm, directly interacts with cytoskeletal protein Septin 12, which is associated with sperm motility. Septin 12 has several isoforms, and we show, that in the Prm2 -/- sperm, the short one (Mw 36 kDa) is mislocalized, while two long isoforms (Mw 40 and 41 kDa) are unexpectedly lost in Prm2 -/- sperm chromatin-bound protein fractions. Septin 12 co-immunoprecipitated with Protamine 2 in the testicular cell lysate of WT mice and with Lamin B1/B2/B3 in co-transfected HEK cells despite we did not observe changes in Lamin B2/B3 protein or SUN4 expression in Prm2 -/- testes. Furthermore, the Prm2 -/- sperm have on average a smaller sperm nucleus and aberrant acrosome biogenesis. In humans, patients with low sperm motility (asthenozoospermia) have imbalanced histone– protamine 1/2 ratio and modified levels of cytoskeletal proteins. We detected retained Septin 12 isoforms (Mw 40 and 41 kDa) in the sperm membrane, chromatin-bound and tubulin/mitochondria protein fractions, which was not true for healthy normozoospermic men. In conclusion, our findings expand the current knowledge regarding the connection between Protamine 2 and Septin 12 expression and localization, resulting in low sperm motility and morphological abnormalities.