Abstract Biophysical cues are essential for guiding skeletal development, but the mechanisms underlying the physical regulation of cartilage and bone formation are unknown. TRPV4 is a cell membrane ion channel responsible for transducing mechanical stimuli as a means of regulating skeletal cell homeostatic processes. Dysregulation of TRPV4 is associated with several skeletal developmental pathologies, indicating its involvement in cartilage and bone development, potentially in a mechanosensing capacity. In this study, we test the hypothesis that mechanically mediated prenatal skeletogenesis depends on TRPV4 activity. We first validate a novel model where we establish that dynamically loading embryonic mouse hindlimb explants cultured ex vivo promotes joint cartilage growth and morphogenesis, but not diaphyseal mineralization. We next reveal that TRPV4 protein expression is mechanically regulated and spatially localized to patterns of high biophysical stimuli in the femoral condyles of cultured limbs. Finally, we demonstrate that TRPV4 activity is crucial for the mechanical regulation of joint cartilage growth and shape, mediated via the control of cell proliferation and matrix biosynthesis, indicating a mechanism by which mechanical loading could direct morphogenesis during joint formation. We conclude that the regulatory pathways initiated by TRPV4 mechanotransduction are essential for the for the cartilage response to physical stimuli during skeletal development. Therefore, TRPV4 may be a valuable target for the development of therapeutic skeletal disease modifying drugs and developmentally-inspired tissue engineering strategies for skeletal repair.

Abstract Mechanical loading is critical for collagen network maintenance and remodelling in adult skeletal tissues, but the role of loading in collagen network formation during development is poorly understood. We test the hypothesis that mechanical loading is necessary for the onset and maturation of spatial localisation and structure of collagens in prenatal cartilage and bone, using in vivo and in vitro mouse models of altered loading. The majority of collagens studied were aberrant in structure or localisation, or both, when skeletal muscle was absent in vivo . Using in vitro bioreactor culture system, we demonstrate that mechanical loading directly modulates the spatial localisation and structure of collagens II and X. Furthermore, we show that mechanical loading in vitro rescues aspects of collagens II and X development from the effects of fetal immobility. In conclusion, our findings show that mechanical loading is a critical determinant of collagen network establishment during prenatal skeletal development. Teaser (One line) Mechanical loading is required for normal establishment and maturation of key collagens during prenatal skeletal development.

Abstract Terrestrial vertebrates have adapted to life on Earth and its constant gravitational field, which exerts load on the body and influences the structure and function of tissues. While the effects of microgravity on muscle and bone homeostasis are well described, the effects of shorter exposures to increased gravitational fields are less well characterized. Here, we exposed zebrafish to 3 and 6g hypergravity from 3-5 days post fertilisation, when key events in jaw cartilage morphogenesis occur. We did not observe changes to growth, or morphology of cartilage or muscle. However, we observed altered mechanical properties of jaw cartilages. We model the impact of these material property changes using Finite Element Analysis and show strain distribution in the jaw is altered following hypergravity. In regions of predicted altered strain we observed local changes to chondrocyte morphology, suggesting altered gravity affects chondrocyte maturation, ultimately leading to changes to cartilage structure and function.

Joint morphogenesis is the process during which distinct and functional joint shapes emerge during pre- and post-natal joint development. In this study, a repeatable semi-automatic protocol capable of providing a 3D realistic developmental map of the prenatal mouse knee joint was designed by combining Optical Projection Tomography imaging (OPT) and a deformable registration algorithm (Sheffield Image Registration toolkit, ShIRT). Eleven left limbs of healthy murine embryos were scanned with OPT (voxel size: 14.63µm) at two different stages of development: Theiler stage (TS) 23 (approximately 14.5 embryonic days) and 24 (approximately 15.5 embryonic days). One TS23 limb was used to evaluate the precision of the displacement predictions for this specific case. The remaining limbs were then used to estimate Developmental Tibia and Femur Maps. Acceptable uncertainties of the displacement predictions were found for both epiphyses (between 0.7 and 1.4 µm, along all directions and anatomical sites) for nodal spacing of 1 voxel. The protocol was found to be reproducible with maximum Modified Housdorff Distance differences equal to 1.9 µm and 1.5 µm for the tibial and femoral epiphyses respectively. The effect of the initial shape of the rudiment affected the developmental maps by 21.7 µm and 21.9 µm for the tibial and femoral epiphyses respectively, which correspond to 1.4 and 1.5 times the voxel size. To conclude, this study proposes a repeatable semi-automatic protocol capable of providing mean 3D realistic developmental map of a developing rudiment allowing researchers to study how growth and adaptation are directed by biological and mechanobiological factors.

Fetal movements are essential for normal development of the human skeleton. When fetal movements are reduced or restricted, infants are at higher risk of developmental dysplasia of the hip and arthrogryposis (multiple joint contractures). Joint shape abnormalities have been reported in mouse models with abnormal or absent musculature, but the effects on joint shape in such models have not been quantified or characterised in detail. In this study, embryonic mouse forelimbs and hindlimbs at a single developmental stage (Theiler Stage 23) with normal, reduced or absent muscle were imaged in 3D. Skeletal rudiments were virtually segmented and rigid image registration was used to reliably align rudiments with each other, enabling repeatable assessment and measurement of joint shape differences between normal, reduced-muscle and absent muscle groups. We demonstrate qualitatively and quantitatively that joint shapes are differentially affected by a lack of, or reduction in, skeletal muscle, with the elbow joint being the most affected of the major limb joints. Surprisingly, the effects of reduced muscle were often more pronounced than those of absent skeletal muscle, indicating a complex relationship between muscle mass and joint morphogenesis. These findings have relevance for human developmental disorders of the skeleton in which abnormal fetal movements are implicated, particularly developmental dysplasia of the hip and arthrogryposis.

Abstract In early limb embryogenesis, synovial joints acquire specific shapes which determine joint motion and function. The process by which the opposing cartilaginous joint surfaces are moulded into reciprocal and interlocking shapes, called joint morphogenesis, is one of the least understood aspect of joint formation and the cell-level dynamics underlying it are yet to be unravelled. In this research, we quantified key cellular dynamics involved in growth and morphogenesis of the zebrafish jaw joint and synthesised them in a predictive computational simulation of joint development. Cells in larval zebrafish jaw joints labelled with cartilage markers were tracked over a forty-eight hour time window using confocal imaging. Changes in distance and angle between adjacent cell centroids resulting from cell rearrangement, volume expansion and extracellular matrix (ECM) deposition were measured and used to calculate the rate and direction of local tissue deformations. We observed spatially and temporally heterogeneous growth patterns with marked anisotropy over the developmental period assessed. There was notably elevated growth at the level of the retroarticular process of the Meckel’s cartilage, a feature known to undergo pronounced shape changes during zebrafish development. Analysis of cell dynamics indicated a dominant role for cell volume expansion in growth, with minor influences from ECM volume increases and cell intercalation. Cell proliferation in the joint was minimal over the timeframe of interest. Synthesising the dynamic cell data into a finite element model of jaw joint development resulted in accurate shape predictions. Our biofidelic computational simulation demonstrated that zebrafish jaw joint growth can be reasonably approximated based on cell positional information over time, where cell positional information derives mainly from cell orientation and cell volume expansion. By modifying the input parameters of the simulation, we were able to assess the relative contributions of heterogeneous growth rates and of growth orientation. The use of uniform rather than heterogeneous growth rates only minorly impacted the shape predictions whereas isotropic growth fields resulted in altered shape predictions. The simulation results suggest that growth anisotropy is the dominant influence on joint growth and morphogenesis. This study addresses the gap of the cellular processes underlying joint morphogenesis, with implications for understanding the aetiology of developmental joint disorders such as developmental dysplasia of the hip and arthrogryposis.

Abstract Skeletal muscle contractions are critical for normal growth and morphogenesis of the skeleton, but it is unclear how the detrimental effects of absent muscle on the bones and joints change over time. Joint size, shape and cavitation, and rudiment length and mineralisation were assessed in multiple rudiments at two developmental stages (Theiler Stage (TS)24 and TS27) in the splotch-delayed “muscleless limb” mouse model and littermate controls. As development progressed, the effects of absent muscle on all parameters except for cavitation become less severe. All major joints in muscleless limbs were qualitatively and quantitatively abnormal in shape at TS24, while, by TS27, most muscleless joint shapes were normal, or nearly normal. In contrast, any joints which were fused at TS24 did not cavitate by TS27. Therefore, recovery in joint shape over development occurred despite absent cavitation. Mineralisation showed the most pronounced changes between TS24 and TS27 in the muscleless limbs. At TS24, all muscleless rudiments studied had less mineralisation than the controls, while at TS27, muscleless limb rudiments had either the same or significantly more mineralisation than controls of the same age. We conclude that the effects of absent muscle on prenatal murine skeletogenesis are most pronounced in early skeletal development and reduce in severity prior to birth. Understanding how mammalian bones and joints continue to develop in an environment without muscle contractions, but with mechanical stimulation due to the movement of the mother, provides important insights into conditions affecting human babies such as developmental dysplasia of the hip and arthrogryposis.

Abstract Endochondral ossification requires coordinated mobilization of osteoblast precursors with blood vessels. During adult bone homeostasis, vessel adjacent osteoblast precursors respond to and are maintained by mechanical stimuli; however, the mechanisms by which these cells mobilize and respond to mechanical cues during embryonic development are unknown. Previously, we found that deletion of the mechanoresponsive transcriptional regulators, YAP and TAZ, from Osterix-expressing osteoblast precursors and their progeny caused perinatal lethality. Here, we show that embryonic YAP/TAZ signaling couples vessel-associated osteoblast precursor mobilization to angiogenesis in developing long bones. Osterix-conditional YAP/TAZ deletion impaired endochondral ossification in the primary ossification center but not intramembranous osteogenesis in the bone collar. Single-cell RNA sequencing revealed YAP/TAZ regulation of the angiogenic chemokine, Cxcl12, which was expressed uniquely in vessel-associated osteoblast precursors. YAP/TAZ signaling spatially coupled osteoblast precursors to blood vessels and regulated vascular morphogenesis and vessel barrier function. Further, YAP/TAZ signaling regulated vascular loop morphogenesis at the chondro-osseous junction to control hypertrophic growth plate remodeling. In human cells, mesenchymal stromal cell co-culture promoted 3D vascular network formation, which was impaired by stromal cell YAP/TAZ depletion, but rescued by recombinant CXCL12 treatment. Lastly, YAP and TAZ mediated mechanotransduction for load-induced osteogenesis in embryonic bone.

Abstract Mechanical stimuli arising from fetal movements are critical factors underlying joint growth. Abnormal fetal movements negatively affect joint shape features with important implications for joint function and health, but the mechanisms by which mechanical forces due to fetal movements influence joint growth are still unclear. In this research, we integrated cell-level data into a novel mechanobiological model of zebrafish jaw joint morphogenesis to identify links between the mechanical stimuli arising from movement and patterns of growth. Larval zebrafish jaw joint growth patterns were quantified from tracked cell-data at several successive developmental stages in the presence or absence of movements. Pharmacological immobilisation, prior to the onset of jaw movements, resulted in growth rate decreases which were stronger along the ventrodorsal axis. Simulations of joint morphogenesis, based on the quantified cell-level data and which integrated mechanical stimuli arising from simulated jaw movements, were used to test hypotheses relating specific mechanical stimuli with the local changes in size and shape. Different types of mechanical stimulation were incorporated into the simulation to provide the mechanoregulated component on growth in addition to the baseline (non mechanoregulated) growth which occurs in the immobilised animals. We found that the magnitude of compression experienced during joint motion when included as the stimulus for mechanoregulated growth could not predict the real, normally loaded shaped joints. However, when the dynamic changes caused by the application of cyclical compression was implemented as the stimulus for mechanoregulated growth, the sizes and shapes of joints were correctly simulated. We conclude therefore that the cyclical application of compression loading due to the dynamic nature of fetal movements underlies the mechanoregulation of prenatal joint morphogenesis. Our results provide a fundamental advance in our understanding of mechanoregulation of the developing joint and increase our understanding of the origins of conditions such as hip dysplasia and arthrogryposis. Author summary The mechanical forces caused by fetal movements are important for normal development of the skeleton, and in particular for joint shape. Several common developmental musculoskeletal conditions such as developmental dysplasia of the hip and arthrogryposis are associated with reduced or restricted fetal movements. Paediatric joint malformations impair joint function and can be debilitating. To understand the origins of such conditions, it is essential to understand how the mechanical forces arising from movements influence joint growth and shape. In this research, we used a computational model of joint growth applied to the zebrafish jaw joint to study the impact of fetal movements on joint growth and shape. We find that the cyclical application of compression loading is critical to the normal growth and shape of the developing joint. Our findings implicate that dynamic compression must be targeted when developing strategies for the treatment of musculoskeletal conditions through targeted physiotherapy.