ABA Receptor Rumbled? The plant hormone abscisic acid (ABA) is critical for normal development and for mediating plant responses to stressful environmental conditions. Now, two papers present analyses of candidate ABA receptors (see the news story by Pennisi ). Ma et al. (p. 1064; published online 30 April) and Park et al. (p. 1068, published online 30 April) used independent strategies to search for proteins that physically interact with ABI family phosphatase components of the ABA response signaling pathway. Both groups identified different members of the same family of proteins, which appear to interact with ABI proteins to form a heterocomplex that can act as the ABA receptor. The variety of both families suggests that the ABA receptor may not be one entity, but rather a class of closely related complexes, which may explain previous difficulties in establishing its identity.

Abstract Uptake and translocation of cationic nutrients play essential roles in physiological processes including plant growth, nutrition, signal transduction, and development. Approximately 5% of the Arabidopsis genome appears to encode membrane transport proteins. These proteins are classified in 46 unique families containing approximately 880 members. In addition, several hundred putative transporters have not yet been assigned to families. In this paper, we have analyzed the phylogenetic relationships of over 150 cation transport proteins. This analysis has focused on cation transporter gene families for which initial characterizations have been achieved for individual members, including potassium transporters and channels, sodium transporters, calcium antiporters, cyclic nucleotide-gated channels, cation diffusion facilitator proteins, natural resistance-associated macrophage proteins (NRAMP), and Zn-regulated transporter Fe-regulated transporter-like proteins. Phylogenetic trees of each family define the evolutionary relationships of the members to each other. These families contain numerous members, indicating diverse functions in vivo. Closely related isoforms and separate subfamilies exist within many of these gene families, indicating possible redundancies and specialized functions. To facilitate their further study, the PlantsT database (http://plantst.sdsc.edu) has been created that includes alignments of the analyzed cation transporters and their chromosomal locations.

Guard cells surround stomatal pores in the epidermis of plant leaves and stems. Stomatal pore opening is essential for CO2 influx into leaves for photosynthetic carbon fixation. In exchange, plants lose over 95% of their water via transpiration to the atmosphere. Signal transduction mechanisms in guard cells integrate hormonal stimuli, light signals, water status, CO2, temperature, and other environmental conditions to modulate stomatal apertures for regulation of gas exchange and plant survival under diverse conditions. Stomatal guard cells have become a highly developed model system for characterizing early signal transduction mechanisms in plants and for elucidating how individual signaling mechanisms can interact within a network in a single cell. In this review we focus on recent advances in understanding signal transduction mechanisms in guard cells.

In pathogen-associated molecular pattern (PAMP)-triggered immunity (PTI), plant cell surface receptors sense potential microbial pathogens by recognizing elicitors called PAMPs. Although diverse PAMPs trigger PTI through distinct receptors, the resulting intracellular responses overlap extensively. Despite this, a common component(s) linking signal perception with transduction remains unknown. In this study, we identify SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK)3/brassinosteroid-associated kinase (BAK)1, a receptor-like kinase previously implicated in hormone signaling, as a component of plant PTI. In Arabidopsis thaliana, AtSERK3/BAK1 rapidly enters an elicitor-dependent complex with FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2), the receptor for the bacterial PAMP flagellin and its peptide derivative flg22. In the absence of AtSERK3/BAK1, early flg22-dependent responses are greatly reduced in both A. thaliana and Nicotiana benthamiana. Furthermore, N. benthamiana Serk3/Bak1 is required for full responses to unrelated PAMPs and, importantly, for restriction of bacterial and oomycete infections. Thus, SERK3/BAK1 appears to integrate diverse perception events into downstream PAMP responses, leading to immunity against a range of invading microbes.

Metal cation homeostasis is essential for plant nutrition and resistance to toxic heavy metals. Many plant metal transporters remain to be identified at the molecular level. In the present study, we have isolated AtNramp cDNAs from Arabidopsis and show that these genes complement the phenotype of a metal uptake deficient yeast strain, smf1 . AtNramp s show homology to the Nramp gene family in bacteria, yeast, plants, and animals. Expression of AtNramp cDNAs increases Cd 2+ sensitivity and Cd 2+ accumulation in yeast. Furthermore, AtNramp3 and AtNramp4 complement an iron uptake mutant in yeast. This suggests possible roles in iron transport in plants and reveals heterogeneity in the functional properties of Nramp transporters. In Arabidopsis , AtNramps are expressed in both roots and aerial parts under metal replete conditions. Interestingly, AtNramp3 and AtNramp4 are induced by iron starvation. Disruption of the AtNramp3 gene leads to slightly enhanced cadmium resistance of root growth. Furthermore, overexpression of AtNramp3 results in cadmium hypersensitivity of Arabidopsis root growth and increased accumulation of Fe, on Cd 2+ treatment. Our results show that Nramp genes in plants encode metal transporters and that AtNramps transport both the metal nutrient Fe and the toxic metal cadmium.

The stomata on the undersides of leaves control the exchange of carbon dioxide and water between plants and the atmosphere. Stomatal pore aperture is regulated by transport of ions and metabolites across guard-cell membranes. Perhaps surprisingly, until now no plant plasma membrane anion channel subunits have been cloned — and the homologues of animal anion channels have been shown not to encode functional ion channels in plants. Now two groups working independently have identified a protein that is an essential component for S-type anion channel function and is required for stomatal closure in response to a variety of physiological and stress stimuli. Termed SLAC1, it is a distant homologue of fungal and bacterial dicarboxylate/malic acid transport proteins. One of two related studies that describe the identification of a protein which is an essential component for S-type anion channel function and is required for stomatal closure in response to a variety of physiological and stress stimuli including carbon dioxide and ozone. Stomatal pores, formed by two surrounding guard cells in the epidermis of plant leaves, allow influx of atmospheric carbon dioxide in exchange for transpirational water loss. Stomata also restrict the entry of ozone — an important air pollutant that has an increasingly negative impact on crop yields, and thus global carbon fixation1 and climate change2. The aperture of stomatal pores is regulated by the transport of osmotically active ions and metabolites across guard cell membranes3,4. Despite the vital role of guard cells in controlling plant water loss3,4, ozone sensitivity1,2 and CO2 supply2,5,6,7, the genes encoding some of the main regulators of stomatal movements remain unknown. It has been proposed that guard cell anion channels function as important regulators of stomatal closure and are essential in mediating stomatal responses to physiological and stress stimuli3,4,8. However, the genes encoding membrane proteins that mediate guard cell anion efflux have not yet been identified. Here we report the mapping and characterization of an ozone-sensitive Arabidopsis thaliana mutant, slac1. We show that SLAC1 (SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED 1) is preferentially expressed in guard cells and encodes a distant homologue of fungal and bacterial dicarboxylate/malic acid transport proteins. The plasma membrane protein SLAC1 is essential for stomatal closure in response to CO2, abscisic acid, ozone, light/dark transitions, humidity change, calcium ions, hydrogen peroxide and nitric oxide. Mutations in SLAC1 impair slow (S-type) anion channel currents that are activated by cytosolic Ca2+ and abscisic acid, but do not affect rapid (R-type) anion channel currents or Ca2+ channel function. A low homology of SLAC1 to bacterial and fungal organic acid transport proteins, and the permeability of S-type anion channels to malate9 suggest a vital role for SLAC1 in the function of S-type anion channels.

This paper reports the identification and functional expression of a gene that is involved in nitrate uptake in plants, a process essential for the assimilation of nitrate and the biological removal of nitrate from the soil solution. The CHL1 gene of Arabidopsis, which when mutated confers resistance to the herbicide chlorate and a decrease in nitrate uptake, was isolated and found to encode a protein with 12 putative membrane-spanning segments. Injection of CHL1 mRNA into Xenopus oocytes produces a nitrate- and pH-dependent membrane depolarization, inward current, and nitrate uptake. These data show that the CHL1 gene encodes an electrogenic nitrate transporter. CHL1 mRNA is found predominantly in roots and displays nitrate- and pH-dependent regulation.

Sodium (Na + ) at high millimolar concentrations in soils is toxic to most higher plants and severely reduces agricultural production worldwide. However, the molecular mechanisms for plant Na + uptake remain unknown. Here, the wheat root high-affinity potassium (K + ) uptake transporter HKT1 was shown to function as a high-affinity K + -Na + cotransporter. High-affinity K + uptake was activated by micromolar Na + concentrations; moreover, high-affinity Na + uptake was activated by K + (half-activation constant, 2.8 μM K + ). However, at physiologically detrimental concentrations of Na + , K + accumulation mediated by HKT1 was blocked and low-affinity Na + uptake occurred (Michaelis constant, ∼16 mM Na + ), which correlated to Na + toxicity in plants. Point mutations in the sixth putative transmembrane domain of HKT1 that increase Na + tolerance were isolated with the use of yeast as a screening system. Na + uptake and Na + inhibition of K + accumulation indicate a possible role for HKT1 in physiological Na + toxicity in plants.

Article15 June 1999free access Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast Stephan Clemens Stephan Clemens Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Present address: Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany Search for more papers by this author Eugene J. Kim Eugene J. Kim Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Search for more papers by this author Dieter Neumann Dieter Neumann Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany Search for more papers by this author Julian I. Schroeder Corresponding Author Julian I. Schroeder Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Search for more papers by this author Stephan Clemens Stephan Clemens Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Present address: Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany Search for more papers by this author Eugene J. Kim Eugene J. Kim Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Search for more papers by this author Dieter Neumann Dieter Neumann Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany Search for more papers by this author Julian I. Schroeder Corresponding Author Julian I. Schroeder Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA Search for more papers by this author Author Information Stephan Clemens1,2, Eugene J. Kim1, Dieter Neumann3 and Julian I. Schroeder 1 1Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093-0116 USA 2Present address: Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany 3Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle (Saale), Germany *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (1999)18:3325-3333https://doi.org/10.1093/emboj/18.12.3325 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Phytochelatins play major roles in metal detoxification in plants and fungi. However, genes encoding phytochelatin synthases have not yet been identified. By screening for plant genes mediating metal tolerance we identified a wheat cDNA, TaPCS1, whose expression in Saccharomyces cerevisiae results in a dramatic increase in cadmium tolerance. TaPCS1 encodes a protein of ∼55 kDa with no similarity to proteins of known function. We identified homologs of this new gene family from Arabidopsis thaliana, Schizosaccharomyces pombe, and interestingly also Caenorhabditis elegans. The Arabidopsis and S.pombe genes were also demonstrated to confer substantial increases in metal tolerance in yeast. PCS-expressing cells accumulate more Cd2+ than controls. PCS expression mediates Cd2+ tolerance even in yeast mutants that are either deficient in vacuolar acidification or impaired in vacuolar biogenesis. PCS-induced metal resistance is lost upon exposure to an inhibitor of glutathione biosynthesis, a process necessary for phytochelatin formation. Schizosaccharomyces pombe cells disrupted in the PCS gene exhibit hypersensitivity to Cd2+ and Cu2+ and are unable to synthesize phytochelatins upon Cd2+ exposure as determined by HPLC analysis. Saccharomyces cerevisiae cells expressing PCS produce phytochelatins. Moreover, the recombinant purified S.pombe PCS protein displays phytochelatin synthase activity. These data demonstrate that PCS genes encode phytochelatin synthases and mediate metal detoxification in eukaryotes. Introduction Heavy metal toxicity poses major environmental and health problems. Cadmium, for example, is a non-essential heavy metal which is toxic to living cells at very low concentrations. Cd2+ ions displace Ca2+ or Zn2+ in proteins and can cause oxidative stress (Stohs and Bagchi, 1995; Goyer, 1997). In humans, Cd2+ is a suspected carcinogen (Lemen et al., 1976). Furthermore the concentration of essential, but at high concentrations toxic, metals such as Cu2+, Zn2+ and Fe2+ is tightly controlled. Several mechanisms are known that allow plants and other organisms to tolerate the presence of toxic non-essential metal ions inside the cell. In bacteria a wide range of efflux pumps, predominantly P-type ATPases, have been shown to mediate metal detoxification (Silver and Phung, 1996). In eukaryotic cells, toxic ions appear to be removed from the cytosol mainly by chelation and sequestration. Schizosaccharomyces pombe and other fungi as well as plants synthesize phytochelatins which chelate Cd2+, Cu2+ and other heavy metal ions (Grill et al., 1985; Rauser, 1995). Phytochelatins are thiolate peptides with the primary structure (γ-Glu-Cys)n-Gly, which are non-translationally synthesized from glutathione (Grill et al., 1989). However, genes encoding phytochelatin synthases have not yet been identified. Low molecular weight phytochelatin–metal complexes are transported into vacuoles by ATP-binding cassette transporters, as shown for S.pombe (Ortiz et al., 1992, 1995). Phytochelatin-deficient Arabidopsis and S.pombe mutants are hypersensitive to Cd2+ (Mutoh and Hayashi, 1988; Howden et al., 1995), thereby demonstrating the importance of phytochelatins for plant and fungal metal tolerance. Furthermore, physiological studies indicate that heavy metal tolerance is one of the prerequisites of heavy metal hyperaccumulation in plants (Krämer et al., 1997; Raskin et al., 1997). With the goal of identifying plant genes involved in Cd2+ resistance we pursued an expression cloning approach in Saccharomyces cerevisiae. Here we report on the cloning and characterization of a family of genes from plants and yeast which encode phytochelatin synthases, enzymes that play a crucial role in metal tolerance. Results Cloning of TaPCS1 A screen was pursued to identify plant genes that confer cellular Cd2+ tolerance. Yeast cells were transformed with a size-selected (>1.5 kb) wheat root library (Schachtman and Schroeder, 1994) and 2×107 cells representing ∼1×106 independent transformants were added to 50 ml of arginine-phosphate liquid medium containing either 20 or 50 μM Cd2+. These Cd2+ concentrations are growth-inhibiting for yeast cells in arginine-phosphate medium. However, the liquid cultures became saturated within 2–4 days. Following saturation, surviving yeast cell aliquots were taken, DNA was extracted and after Escherichia coli transformation the pYES2 inserts were analyzed. All inserts from the same culture showed identical restriction patterns indicating that the liquid cultures grew to saturation starting from one or a small number of yeast cells containing the same wheat cDNA. In six liquid cultures of this screen (which included two repetitions with newly transformed cells) a single cDNA, differing only in the length of the 5′ untranslated regions, was cloned. The cDNA was initially named CdR (for Cd2+ resistance) but after further characterization it was named TaPCS1 for its function in Triticum aestivum phytochelatin synthesis. TaPCS1 expression makes S.cerevisiae more Cd2+ tolerant TaPCS1 expression mediated a dramatic increase in Cd2+ tolerance of S.cerevisiae cells. TaPCS1-expressing cells grew to saturation in the presence of Cd2+ concentrations which completely inhibited growth of control cells harboring the empty pYES2 plasmid (Figure 1A). Dose–response analyses showed that TaPCS1-expressing cells tolerate 15-fold higher Cd2+ concentrations than control cells (Figure 1B) [K0.5(TaPCS1) = 90 μM Cd2+; K0.5(control) = 6 μM Cd2+]. TaPCS1-expressing cells grown in the absence of the inducer galactose also displayed a strong degree of Cd2+ tolerance, suggesting that low levels of TaPCS1 are sufficient for Cd2+ resistance and indicating a catalytic role for TaPCS1 in mediating Cd2+ tolerance (Figure 1C), rather than tolerance by direct binding of metals to TaPCS1. Even with glucose as the carbon source, which represses the GAL1 promoter, a slight enhancement of growth was seen in TaPCS1-containing cells (data not shown), further suggesting a catalytic activity of TaPCS1. Figure 1.TaPCS1 expression renders yeast cells more Cd2+ tolerant. (A) Control cells [INVSc1 cells (Invitrogen, Carlsbad, CA) carrying the empty pYES2 plasmid] (squares) and TaPCS1 expressing cells (circles) were grown in YNB (1% sucrose/1% galactose) containing either no (open symbols) or 200 μM Cd2+ (filled symbols). (B) Growth in YNB (1% sucrose/1% galactose) of control cells (open circles) and TaPCS1 expressing cells (filled circles) at different Cd2+ concentrations. OD600 after 24 h is shown. (C) Growth in YNB (2% raffinose) of control cells (open circles) and TaPCS1 expressing cells (filled circles) at different Cd2+ concentrations. OD600 of cultures after 40 h is shown. Download figure Download PowerPoint Sequence analysis and TaPCS1 homologs The TaPCS1 open reading frame (ORF) (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. AF093752) encodes a polypeptide with a predicted mass of 55 kDa. The deduced amino acid sequence shows no homology to any protein of known function. However, homology was found for the Arabidopsis thaliana expressed sequence tag (EST) G11G3T7 (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. W43439), a S.pombe hypothetical 46.7 kDa protein C3H1.10 (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. Z68144), and the Caenorhabditis elegans ORF F54D5.1 (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. Z66513). These sequences are 55, 28 and 32% identical at the amino acid level, respectively (Figure 2A). TaPCS1 and its homologs thus constitute a new gene family. The homologs from Arabidopsis (AtPCS1) and S.pombe (SpPCS) also confer strong Cd2+ tolerance when expressed in S.cerevisiae (Figure 2B). Low-stringency DNA gel blot analysis in Arabidopsis suggested the presence of more than one AtPCS homolog (data not shown). Meanwhile, a second Arabidopsis gene (AtPCS2, DDBJ/EMBL/GenBank accession No. AC003027) and a second C.elegans gene (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. AL023633) with homology to the PCS genes have been sequenced through genome sequencing efforts. Figure 2.PCS gene family. (A) CLUSTAL W alignment (Thompson et al., 1994) of the amino acid sequences of wheat (TaPCS1), Arabidopsis (AtPCS1), S.pombe (SpPCS) and C.elegans (CePCS1). Identical amino acid residues are in black boxes, similar amino acid residues in light boxes. (B) Growth of control cells (carrying the empty pYES2 plasmid) and cells expressing either TaPCS1, AtPCS1 or SpPCS on YNB medium without (left) and with 100 μM Cd2+ (middle). Download figure Download PowerPoint TaPCS1 mediates an increase in Cd2+ accumulation One possible mechanism underlying Cd2+ tolerance is an efflux of Cd2+ ions as observed in many bacteria (Silver and Phung, 1996). This possibility was investigated by measuring the accumulation of Cd2+ by control and TaPCS1 expressing cells grown at Cd2+ concentrations that do not significantly affect the growth of even the control cells. As shown in Figure 3, TaPCS1 expression led to an increase in Cd2+ accumulation by ∼30–50% during a 24 h culture period (n = 3). Similar results were found for the Arabidopsis homolog (n = 2, data not shown). We interpreted this finding as evidence in support of PCS1-dependent Cd2+ chelation or sequestration. Figure 3.TaPCS1-expressing cells accumulate more Cd2+ than control cells. Yeast cells carrying the empty pYES2 plasmid (white bars) and TaPCS1-expressing cells (black bars) were grown in arginine-phosphate medium containing different non-inhibitory Cd2+ concentrations. After 24 h cells were harvested, washed and the amount of Cd2+ accumulated inside the cells was determined using 109Cd2+. Error bars indicate SE, n = 3. Download figure Download PowerPoint TaPCS1 confers Cd2+ tolerance even in vacuolar mutants Sequestration of Cd2+ and other heavy metal ions into vacuoles is a well-characterized mechanism of detoxification (Rea et al., 1998). One postulated pathway for plants that would function in parallel to the transport of Cd–phytochelatin complexes into vacuoles is a Cd2+/H+ exchanger (Salt and Wagner, 1993). To determine whether TaPCS1 is involved in this process we expressed TaPCS1 in a Δvma4 strain, which lacks a functional vacuolar ATPase and therefore cannot establish a pH gradient (Ho et al., 1993), required for Cd2+ uptake via the Cd2+/H+ exchanger. Growth assays with the Δvma4 and the parental strain showed that TaPCS1 still confers Cd2+ tolerance (n = 3, data not shown). Furthermore, we expressed TaPCS1 in the yeast strain Δvps18, which fails to form any structures morphologically resembling normal vacuoles (Robinson et al., 1991). As expected, this strain is significantly more sensitive to Cd2+ than the parental strain (Figure 4, open circles). Interestingly, TaPCS1 expression again led to a strong increase in Cd2+ tolerance (Figure 6A, filled circles). Figure 4.Expression of TaPCS1 in Δvps18, a S.cerevisiae strain lacking morphologically visible vacuoles (Robinson et al., 1991), still confers a Cd2+ tolerance phenotype. Cells carrying the empty pYES2 plasmid (open circles) and cells expressing TaPCS1 (closed circles) were grown in YNB medium in the presence of different Cd2+ concentrations. Download figure Download PowerPoint Figure 5.A S.pombe strain with a disruption of SpPCS shows increased metal sensitivity. (A) Low-stringency Southern blot of S.pombe genomic DNA probed with SpPCS. Digests: lane 1, BamHI; lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI. (B) A SpPCS knockout strain (ΔSpPCS) and as controls a strain transformed with the empty plasmid pTZura4 (Contr.) and a transformant with a non-homologous integration of the knockout construct (Sp3) were grown on EMM-ura containing either 0 or 10 μM Cd2+. (C) The marker-transformed control strain (open circles) and the ΔSpPCS strain (filled circles) were grown in liquid EMM-ura in the presence of different Cu2+ concentrations. OD was measured after 24 h of growth. Download figure Download PowerPoint Figure 6.Phytochelatin synthesis in cells expressing PCS. (A) Growth of S.cerevisiae cells expressing either TaPCS1 (circles) or an Arabidopsis metallothionein (S.Clemens and J.I.Schroeder, unpublished data) (squares) in the presence of Cd2+ (200 μM for TaPCS1, 60 μM for metallothionein) following a 6 h preincubation with different concentrations of BSO (L-buthionine sulfoxime), a glutathione synthesis inhibitor. OD was measured 18 h after addition of Cd2+. (B and C) Extracts of Cd2+-treated S.pombe and S.cerevisiae cells were labeled with monobromobimane and analyzed by HPLC using a reversed-phase column and fluorescence detection. (B) Schizosaccharomyces pombe wild-type (top) and S.pombe knockout (bottom), (C) S.cerevisiae expressing TaPCS1 (top) and S.cerevisiae wild-type (bottom). The peaks labeled 1 and 2 in B and C are identical based on co-injection experiments. They represent PC2 and PC3 as shown by comparison of retention times with standards synthesized on an Abimed peptide synthesizer (as described in Materials and methods). Download figure Download PowerPoint SpPCS deletion results in metal sensitivity To investigate the physiological role of the PCS genes more directly, we generated a deletion mutant of SpPCS in S.pombe. First, Southern analysis of S.pombe genomic DNA was performed to search for additional PCS homologs. Under low-stringency conditions no indication of sequences homologous to SpPCS could be detected (Figure 5A), demonstrating that SpPCS is a single-copy gene in this organism. Subsequently, the SpPCS gene was deleted by a one-step gene disruption using the ura4 marker. The Cd2+ sensitivity of S.pombe with a disruption of the SpPCS gene (ΔSpPCS) was tested in media containing various Cd2+ concentrations. For controls a strain transformed with the empty plasmid pTZura4 and a transformant with a non-homologous integration of the knockout construct (Sp3) were analyzed. In the absence of Cd2+, the knockout strain grew normally (Figure 5B, top). Growth of the knockout strain was more strongly inhibited by Cd2+ than that of the two different control strains (Figure 5B). Growth of the knockout strain was also more sensitive than control strains to copper (Figure 5C), showing a role for SpPCS in resistance to Cu2+. PCS genes are involved in phytochelatin synthesis The findings indicating a catalytic role of the PCS genes in Cd2+ sequestration (Figure 1C) indicated a possible role for the PCS gene family in phytochelatin synthesis. Glutathione is a precursor required for phytochelatin synthesis (Grill et al., 1989). Pre-treatment of TaPCS1-expressing S.cerevisiae with the glutathione biosynthesis inhibitor BSO (L-buthionine sulfoxime) reduced the TaPCS1-mediated Cd2+ tolerance in a dose-dependent manner (Figure 6A, circles). In controls, expression of an Arabidopsis metallothionein (S.Clemens and J.I.Schroeder, unpublished results) showed no effect of BSO on metallothionein-dependent Cd2+ tolerance (Figure 6A, filled squares). Note that TaPCS1 expressing cells showed a significantly higher growth rate at 200 μM Cd2+ than that of metallothionein-expressing cells at only 60 μM Cd2+ (Figure 6A). Wild-type S.pombe cells (control) and the ΔSpPCS strain were analyzed for phytochelatin synthesis upon Cd2+ exposure by fluorescence HPLC. Peaks showing retention times identical to the synthesized phytochelatin standards, PC2 and PC3, were found in extracts from wild-type cells (Figure 6B, top, peaks 1 and 2) but were absent in extracts from ΔSpPCS cells (Figure 6B, bottom). Thus, the increased Cd2+ sensitivity of the S.pombe knockout is correlated with a deficiency in phytochelatin synthesis. Furthermore, TaPCS1-expressing S.cerevisiae cells synthesized compounds following Cd2+ treatment (Figure 6C, top) that were not formed in wild-type cells (Figure 6C, bottom). Those compounds showed retention times identical to PC2 and PC3 which were not observed in the S.cerevisiae controls, demonstrating that TaPCS1 expression is sufficient to elicit the synthesis of phytochelatins in an organism proposed to not normally form phytochelatins (Rauser, 1995). Phytochelatin synthesis in TaPCS1-expressing cells can also be elicited by treatment with Cu2+ or Zn2+ (data not shown). PCS proteins catalyze phytochelatin synthesis PCS enzyme assays with crude extracts from S.pombe marker-transformed cells and ΔSpPCS cells showed that the knockout strain lacks PCS activity (Figure 7A, bottom). In extracts from control cells, PC2 formation from glutathione was clearly detectable (Figure 7A, top, peak 2), similar to previous reports using purified enzyme preparations (Grill et al., 1989; Hayashi et al., 1991). A purified recombinant Arabidopsis PCS protein showed phytochelatin synthase activity in vitro (P.Rea, University of Pennsylvania, personal communication). Thus, the ΔSpPCS strain provided a suitable background for the expression of a tagged SpPCS protein in order to test directly whether the PCS proteins catalyze phytochelatin synthesis. We expressed SpPCS with an N-terminal hemagglutinin (HA)-tag (SpPCS-HA) in the knockout strain and found that this construct restores metal tolerance, PCS enzyme activity and the ability to form PC2 and PC3 (data not shown). Immunoblots of extracts from cells expressing the HA-tagged SpPCS protein shows a band at ∼46 kDa, corresponding to the predicted molecular weight of SpPCS, which is recognized by a monoclonal anti-HA antibody (BAbCo, Berkeley, CA) (Figure 7B, left). No signal was detected in extracts from control ΔSpPCS cells containing the empty pSGP73 plasmid (Figure 7B, right). Figure 7.PCS mediates phytochelatin synthesis. (A) Crude extracts of S.pombe control (top) or ΔSpPCS (bottom) cells were incubated in 200 mM Tris–Cl (pH 8.0), 1 mM DTT, 1 mM GSH and 0.1 mM CdCl2 at 30°C for 30–120 min, and reaction products were monobromobimane-labeled and analyzed by HPLC. Peak 1 corresponds to free GSH, and peak 2 represents PC2. (B) Western blot analysis of extracts from ΔSpPCS cells harboring SpPCS-HA (left) or empty vector (right) using anti-HA monoclonal antibody (BAbCo, Berkeley, CA). Sizes of molecular mass standards run in parallel are indicated. (C) SpPCS-HA was purified from crude extracts of cells expressing SpPCS-HA using anti-HA antibody affinity column. Protein was eluted with 5 mg HA peptide (YPYDVPDYA) and the eluted fraction analyzed by SDS–PAGE (left) and Western blotting (right). A second band, possibly a proteolytic fragment of the 46 kDa SpPCS-HA, is detected at ∼30 kDa. (D) Phytochelatin synthesis by purified SpPCS-HA. Affinity purified SpPCS-HA was assayed for phytochelatin synthase activity, and the products labeled and analyzed by HPLC as described in (A). Peaks 1 and 2 represent free GSH and PC2, respectively. Download figure Download PowerPoint SpPCS-HA was purified using the monoclonal HA-antibody coupled to Sepharose (BAbCo, Berkeley, CA). The fraction eluted with synthesized HA peptide (YPYDVPDYA) was analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis. Silver staining of the gel showed two bands, one at ∼46 kDa, the same as found for the anti-HA-immunoreactive band detected from extracts of SpPCS-HA expressing cells, and a lower molecular weight band of ∼30 kDa (Figure 7C, left). Western blot analysis of the eluate fraction demonstrated cross-reactivity of both polypeptides to anti-HA antibodies (Figure 7C, right). Recognition of the 30 kDa protein by anti-HA antibodies, combined with the fact that this band was not detected from lysates of SpPCS-HA expressing and control cells (Figure 7B), suggest that the polypeptide might represent a proteolytic degradation product of the 46 kDa protein which may have arisen during purification. Aliquots of the peptide eluate were further analyzed for PCS enzyme activity. As shown in Figure 7D, HPLC analysis of the monobromobimane-derivatized reaction products shows formation of a peak corresponding to PC2 from glutathione and Cd2+, thereby demonstrating PCS enzyme activity in the fraction containing SpPCS-HA. TaPCS1 expression is constitutive and enhanced by Cd2+ TaPCS1 mRNA could not be detected by RNA blot analysis of wheat root mRNA. To determine whether the TaPCS1 gene is transcribed in wheat seedlings, we performed RT–PCR experiments with TaPCS1 specific primers. Fragments of the expected size were detectable for both root (Figure 8, top) and shoot samples (not shown). Expression of AtPCS1 in Arabidopsis was also analyzed by RT–PCR. The results in Arabidopsis were the same as found for TaPCS1 (data not shown), showing that both TaPCS1 and AtPCS1 are transcribed in vivo. To determine whether exposure to Cd2+ treatment affected TaPCS1 expression in wheat we used wheat cDNA together with different amounts of competitor DNA in PCRs. Comparison of the band intensity indicated a 5- to 10-fold higher concentration of TaPCS1 message in wheat roots treated with 100 μM Cd2+ (Figure 8). Figure 8.TaPCS1 expression in roots is induced by Cd2+ as shown by competitive PCR. RNA was isolated from 4-day-old wheat roots that were either untreated or treated with 100 μM Cd2+ for 6 h. First-strand cDNA was made and 10 ng were used as a template in PCRs. Competitor DNA used in this study was a PCR fragment amplified from genomic DNA which was ∼100 bp longer than the cDNA-amplified fragment because of the presence of an intron. The indicated amounts of competitor DNA were added. Aliquots were analyzed by agarose gel electrophoresis. The experiment was repeated twice with similar results. Download figure Download PowerPoint Discussion We have isolated and functionally characterized a novel family of genes in several different organisms that mediate a dramatic increase in Cd2+ tolerance when expressed in S.cerevisiae. Cadmium accumulation experiments, TaPCS1 induction in roots, glutathione inhibitor studies and analysis in several yeast mutant backgrounds, together with the Cd2+ and Cu2+ sensitivity of a SpPCS disruption mutant in S.pombe show a central physiological role of the PCS gene family for metal tolerance. The PC deficiency of a S.pombe knockout strain, the phytochelatin synthesis observed in TaPCS1-expressing S.cerevisiae cells upon Cd2+ exposure and the phytochelatin synthase activity of purified recombinant SpPCS suggest that these genes mediate phytochelatin synthesis. TaPCS1 was identified through an expression cloning strategy in S.cerevisiae by searching for clones mediating high tolerance to Cd2+ in the growth medium. TaPCS1 expression enabled yeast cells to grow at >15-fold higher Cd2+ concentrations than control cells. Identification of TaPCS1 using this approach was greatly enhanced by the fact that the screening was restricted to a >1.5 kb fraction of a cDNA library (Schachtman and Schroeder, 1994), which helped eliminate the cloning of cDNAs encoding small and abundant heavy metal-binding peptides such as metallothioneins. Selection of transformants exhibiting elevated tolerance to Cd2+ was performed in liquid medium in order to provide extremely homogeneous screening conditions, while easily permitting the screen to be performed in parallel under different levels of selective pressure. This screening method also allowed the isolation of those cDNAs most effective in conferring Cd2+ tolerance. The efficacy of this approach is demonstrated by the fact that, in independent experiments, TaPCS1 was the only cDNA isolated. A role in metal tolerance A number of findings suggest a catalytic role of the PCS gene products in metal detoxification. The observed increase in Cd2+ accumulation (Figure 3) upon TaPCS1 expression in S.cerevisiae showed that the tolerance phenotype is not based on the exclusion of the toxic metal, the dominant mechanism of metal detoxification in bacteria (Silver and Phung, 1996). On the contrary, the TaPCS1-dependent increase in Cd2+ accumulation is consistent with the hypothesis that TaPCS1 is involved in Cd2+ sequestration as, for instance, S.pombe cells overexpressing the ABC-type transporter hmt1 accumulate more Cd2+ (Ortiz et al., 1992). Furthermore, TaPCS1 can confer strong Cd2+ tolerance even when expressed at low levels under non-inducing conditions (Figure 1C). Because most toxic materials inside plant cells are sequestered in vacuoles we performed Cd2+ sensitivity assays with yeast vacuolar mutants. The TaPCS1-mediated increase in Cd2+ tolerance which was still observed in yeast strains that lack either a functional V-ATPase (Ho et al., 1993) or morphologically typical discernible vacuoles (Robinson et al., 1991; Figure 4) led us to conclude that a direct role for TaPCS1 in vacuolar transport of Cd2+ ions appears unlikely, although an indirect involvement or early reaction preceding vacuolar uptake cannot be ruled out. PCS genes mediate phytochelatin synthesis Synthesis of phytochelatins from glutathione upon metal exposure has been shown to be directly involved in plant metal tolerance (Zenk, 1996). Phytochelatin synthase was proposed to catalyze the first step in the sequestration of Cd2+ as Cd–phytochelatin complexes in vacuoles. Because a cDNA encoding a phytochelatin synthase has not been isolated yet and our data suggested a PCS-mediated sequestration of Cd2+ we tested the hypothesis that the PCS genes are involved in phytochelatin synthesis. Consistent with the aforementioned observations in plants, Cd2+ hypersensitive mutants of S.pombe have been isolated which show reduced phytochelatin levels (Mutoh and Hayashi, 1988). Thus, the observed Cd2+ hypersensitivity of the ΔSpPCS strain (Figure 6B) provided further indication for the hypothesis that PCS genes directly mediate phytochelatin synthesis. Cu2+ sensitivity is also consistent with a phytochelatin deficiency as phytochelatins form complexes with several toxic metals and with copper ions as well (Rauser, 1995). To test more directly the hypothesis that PCS genes mediate phytochelatin synthesis, we first studied the effect of BSO, a potent, specific inhibitor of glutathione biosynthesis, on TaPCS1-mediated Cd2+ tolerance. BSO has been previously shown to reduce synthesis of phytochelatins and phytochelatin-associated Cd2+ tolerance in plant cell cultures (Steffens, 1990). The BSO-dependent reduction in Cd2+ tolerance of TaPCS1 expressing S.cerevisiae cells (Figure 6A) demonstrated a role for glutathione biosynthesis on TaPCS1-mediated Cd2+ resistance. In contrast, control cells overexpressing metallothioneins showed no BSO sensitivity and less Cd2+ resistance (Figure 6A). Subsequently, HPLC analysis of monobromobimane-labeled extracts from Cd2+-treated wild-type S.pombe showed the expected peaks for PC2 and PC3, the dominant phytochelatins of fission yeast (Kondo et al., 1985) (Figure 6B, top, peaks 1 and 2). PC2 and PC3 were undetectable in extracts of Cd2+-treated ΔSpPCS cells (Figure 6B, bottom). Correspondingly, no PCS enzyme activity was detectable in protein extracts of the knockout strain (Figure 7A, bottom), thereby establishing a role for SpPCS in phytochelatin synthesis. Furthermore, extracts of S.cerevisiae control cells did not