Single-molecule localization microscopy is a powerful tool for visualizing subcellular structures, interactions and protein functions in biological research. However, inhomogeneous refractive indices inside cells and tissues distort the fluorescent signal emitted from single-molecule probes, which rapidly degrades resolution with increasing depth. We propose a method that enables the construction of an in situ 3D response of single emitters directly from single-molecule blinking datasets, and therefore allows their locations to be pinpointed with precision that achieves the Cramér-Rao lower bound and uncompromised fidelity. We demonstrate this method, named in situ PSF retrieval (INSPR), across a range of cellular and tissue architectures, from mitochondrial networks and nuclear pores in mammalian cells to amyloid-β plaques and dendrites in brain tissues and elastic fibers in developing cartilage of mice. This advancement expands the routine applicability of super-resolution microscopy from selected cellular targets near coverslips to intra- and extracellular targets deep inside tissues.

Accurately replicating and analyzing cellular responses to mechanical cues is vital for exploring metastatic disease progression. However, many of the existing in vitro platforms for applying mechanical stimulation seed cells on synthetic substrates. To better recapitulate physiological conditions, a novel actuating platform is developed with the ability to apply tensile strain on cells at various amplitudes and frequencies in a high-throughput multi-well culture plate using a physiologically-relevant substrate. Suspending fibrillar fibronectin across the body of the magnetic actuator provides a matrix representative of early metastasis for 3D cell culture that is not reliant on a synthetic substrate. This platform enables the culturing and analysis of various cell types in an environment that mimics the dynamic stretching of lung tissue during normal respiration. Metabolic activity, YAP activation, and morphology of breast cancer cells are analyzed within one week of cyclic stretching or static culture. Further, matrix degradation is significantly reduced in breast cancer cell lines with metastatic potential after actuation. These new findings demonstrate a clear suppressive cellular response due to cyclic stretching that has implications for a mechanical role in the dormancy and reactivation of disseminated breast cancer cells to macrometastases.

Abstract The development of a functional vertebrate musculoskeletal system requires the combination of contractile muscle and extracellular matrix (ECM)-rich tendons that transmit muscle-generated force to bone. Despite the different embryologic origins, muscle and tendon integrate at the myotendinous junction (MTJ) to seamlessly connect cells and ECM across this interface. While the cell-cell signaling factors that direct development have received considerable attention, how and when the ECM linking these tissues is deposited remains unknown. To address this gap, we analyzed the 3D distribution of different ECM and the influence of skeletal muscle in forelimbs from wildype (WT) and muscle-less Pax3 Cre/Cre mice. At E11.5, prior to MTJ integration, an aligned ECM was present at the presumptive insertion of the long triceps into the WT ulna. Mechanically robust tendon-like and muscle compartmentalization structures, positive for type I collagen, type V collagen, and fibrillin-2, still formed when muscle was knocked out. However, MTJ-specific ECM was not observed when muscle was absent. Our results show that an ECM-based template forms independent of muscle, but muscle is needed for the proper assembly of ECM at the MTJ. Summary statement An aligned ECM template connects tendon and muscle during limb development, independent of muscle progenitor migration into the limb; however, the assembly of MTJ-specific ECM requires the presence of muscle.

Summary The extracellular matrix (ECM) is an integral part of multicellular organisms, connecting different cell layers and tissue types. During morphogenesis and growth, tissues undergo substantial reorganization involving cellular proliferation, migration, and differentiation. While it is intuitive that the ECM remodels in concert, little is known regarding how matrix composition and organization change during development. We utilized tissue fractionation and mass spectrometry to define ECM protein (matrisome) dynamics during murine forelimb development and resolved significant differences in ECM composition as a function of development, disease and tissue type. Additionally, we used bioorthogonal non-canonical amino acid tagging (BONCAT) to label newly synthesized ECM within the developing forelimb. We demonstrate the feasibility of using BONCAT to enrich for newly synthesized matrisome components and identified differences in ECM synthesis between morphogenesis and growth. This resource will guide future research investigating the role of the matrisome during complex tissue development.

ABSTRACT Single-molecule localization microscopy is a powerful tool in visualizing organelle structures, interactions, and protein functions in biological research. However, whole-cell and tissue specimens challenge the achievable resolution and depth of nanoscopy methods. As imaging depth increases, photons emitted by fluorescent probes, the sole source of molecular positions, were scattered and aberrated, resulting in image artifacts and rapidly deteriorating resolution. We propose a method to allow constructing the in situ 3D response of single emitters directly from single-molecule dataset and therefore allow pin-pointing single-molecule locations with limit-achieving precision and uncompromised fidelity through whole cells and tissues. This advancement expands the routine applicability of super-resolution imaging from selected cellular targets near coverslips to intra- and extra-cellular targets deep inside tissues. We demonstrate this across a range of cellular-tissue architectures from mitochondrial networks, microtubules, and nuclear pores in 2D and 3D cultures, amyloid-β plaques in mouse brains to developing cartilage in mouse forelimbs.

Abstract Background The extracellular matrix (ECM) is a network of proteins and glycosaminoglycans that provides structural and biochemical cues to cells. In the kidney, the ECM is critical for nephrogenesis; however, the dynamics of ECM composition and how it relates to 3D structure during development is unknown. Methods Using embryonic day (E)14.5, E18.5, postnatal day (P)3, and adult kidneys, we fractionated proteins based on differential solubilities, performed liquid chromatography tandem-mass spectrometry, and identified changes in ECM protein content (matrisome). Decellularized kidneys were stained for ECM proteins and imaged in 3D using confocal microscopy. Results We observed an increase in interstitial ECM that connect the stromal mesenchyme to the basement membrane (TNXB, COL6A1, COL6A2, COL6A3) between the embryo and adult, and a transient elevation of interstitial matrix proteins (COL5A2, COL12A1, COL26A1, ELN, EMID1, FBN1, LTBP4, THSD4) at perinatal timepoints. Basement membrane proteins critical for metanephric induction (FRAS1, FREM2) were highest in the embryo, whereas proteins necessary for glomerular basement membrane integrity (COL4A3, COL4A4, COL4A5, LAMB2) were more abundant in the adult. 3D visualization revealed a complex interstitial matrix that dramatically changed over development, including the perinatal formation of fibrillar structures that appear to support the medullary rays. Conclusion By correlating 3D ECM spatiotemporal organization with global protein abundance, we identified novel changes in the interstitial matrix during kidney development. This new information regarding the ECM in developing kidneys offers the potential to inform the design of regenerative scaffolds that can guide nephrogenesis in vitro . Significance statement End-stage renal disease is increasing and there are a limited number of organs available for transplantation. Therefore, researchers have focused on understanding how cellular signaling influences kidney development to expand strategies to rebuild a kidney. However, the extracellular matrix (ECM), another critical component that biomechanically regulates nephrogenesis, has been largely neglected. This paper combines proteomics and 3D imaging of the murine kidney to resolve previously undescribed dynamics of the interstitial matrix in the cortex and corticomedullary junction during development. Combined with cell and growth factors, scaffolds modeled after the composition and organization of the developmental ECM have the potential to improve tissue engineering models of the kidney, like organoids.

Soft tissue injuries (such as ligament, tendon, and meniscus tears) are the result of extracellular matrix damage from excessive tissue stretching. Deformation thresholds for soft tissues, however, remain largely unknown due to a lack of methods that can measure and compare the spatially heterogeneous damage and deformation that occurs in these materials. Here, we propose a method for defining tissue injury criteria : multimodal strain limits for biological tissues analogous to yield criteria that exist for crystalline materials. Specifically, we developed a method for defining injury criteria for mechanically-driven fibrillar collagen denaturation in soft tissues, using regional multimodal deformation and damage data. We established this new method using the murine medial collateral ligament (MCL) as our model tissue. Our findings revealed that multiple modes of deformation contribute to collagen denaturation in the murine MCL, contrary to the common assumption that collagen damage is driven by strain in the fiber direction alone. Remarkably, our results indicated that hydrostatic strain, or volumetric expansion, may be the best predictor of mechanically-driven collagen denaturation in ligament tissue, suggesting crosslink-mediated stress transfer plays a role in molecular damage accumulation. This work demonstrates that collagen denaturation can be driven by multiple modes of deformation and provides a method for defining deformation thresholds, or injury criteria, from spatially heterogeneous data.

ABSTRACT Reciprocal interactions between the cell nucleus and the extracellular matrix lead to macroscale tissue phenotype changes. The extracellular environment is physically linked to the nuclear envelope and provides cues to maintain nuclear structure and cellular homeostasis regulated in part by mechanotransduction mechanisms. However, little is known about how structure and properties of the extracellular matrix in living tissues impacts nuclear mechanics, and current experimental challenges limit the ability to detect and directly measure nuclear mechanics while cells are within the native tissue environment. Here, we hypothesized that enzymatic disruption of the tissue matrix results in a softer tissue, affecting the stiffness of embedded cell and nuclear structures. We aimed to directly measure nuclear mechanics without perturbing the native tissue structure to better understand nuclear interplay with the cell and tissue microenvironments. To accomplish this, we expanded an atomic force microscopy needle-tip probe technique that probes nuclear stiffness in cultured cells to measure the nuclear envelope and cell membrane stiffness within native tissue. We validated this technique by imaging needle penetration and subsequent repair of the plasma and nuclear membranes of HeLa cells stably expressing the membrane repair protein CHMP4B-GFP. In the native tissue environment ex vivo , we found that while enzymatic degradation of viable cartilage tissues with collagenase 3 (MMP-13) and aggrecanase-1 (ADAMTS-4) decreased tissue matrix stiffness, cell and nuclear membrane stiffness is also decreased. Finally, we demonstrated the capability for cell and nucleus elastography using the AFM needle-tip technique. These results demonstrate disruption of the native tissue environment that propagates to the plasma membrane and interior nuclear envelope structures of viable cells.

Abstract Identification and quantitation of newly synthesized proteins (NSPs) are critical to understanding protein dynamics in development and disease. Probing the nascent proteome can be achieved using non-canonical amino acids (ncAAs) to selectively label the NSPs utilizing endogenous translation machinery, which can then be quantitated with mass spectrometry. Since its conception, ncAA labeling has been applied to study many in vitro systems and more recently the in vivo proteomes of complex organisms such as rodents. In vivo labeling is typically achieved by introducing ncAAs into diet, which requires extended labeling times. We have previously demonstrated that labeling the murine proteome is feasible via injection of azidohomoalanine (Aha), a ncAA and methionine (Met) analog, without the need for Met depletion. With the ability to isolate NSPs without applying stress from dietary changes, Aha labeling can address biological questions wherein temporal protein dynamics are significant. However, accessing this temporal resolution requires a more complete understanding of Aha distribution kinetics in tissues. Furthermore, studies of physiological effects of ncAA administration have been limited to gross observation of animal appearance. To address these gaps, we created a deterministic, compartmental model of the biokinetic transport and incorporation of Aha in mice. Parameters were informed from literature and experimentally. Model results demonstrate the ability to predict Aha distribution and labeling under a variety of dosing paradigms and confirms the use of the model as a tool for design of future studies. To establish the suitability of the method for in vivo studies, we investigated the impact of Aha administration on normal physiology by analyzing the plasma metabolome following Aha injection. We show that Aha administration does not significantly perturb cellular functions as reflected by an unchanged plasma metabolome compared to non-injected controls. Author Summary As the machinery of life, proteins play a key role in dynamic processes within an organism. As such, the response of the proteome to perturbation is increasingly becoming a critical component of biological and medical studies. Dysregulation of protein mechanisms following exposure to experimental treatment conditions can implicate physiological mechanisms of health and disease, elucidate toxin/drug response, and highlight potential targets for novel therapies. Traditionally, these questions have been probed by studying perturbations in total proteins following an experimental treatment. However, the proteome is expansive and noisy, often an early response can be indiscernible against the background of unperturbed proteins. Here, we apply a technique to selectively label newly synthesized proteins, which enables capturing early changes in protein behavior. We utilize an amino acid analog that naturally incorporates into proteins, and investigate the tissue distribution, protein labeling efficiency, and potential physiological impact of this analog in mice. Our results demonstrate that we can reproducibly predict protein labeling and that the administration of this analog does not significantly alter in vivo physiology over the course of our experimental study. We further present a computational model that can be used to guide future experiments utilizing this technique to study proteomic responses to stimuli.

Environmental mechanical cues are critical to guide cell fate. Forces transmit to the nucleus through the Linker of Nucleo- and Cytoskeleton (LINC) complex and are thought to influence the organization of chromatin that is related to cell differentiation; however, the underlying mechanisms are unclear. Here, we investigated chromatin reorganization during murine cardiac development and found that cardiomyocytes establish a distinct architecture characterized by relocation of H3K9me3-modified chromatin from the nuclear interior to the periphery and co-localization to myofibrils. This effect was abrogated in stiff environments that inhibited cardiomyocyte contractility, or after LINC complex disruption, and resulted in the relocation of H3K27me3-modified chromatin instead. By generating high-resolution intra-nuclear strain maps during cardiomyocyte contraction, we discovered that the reorganization of H3K9me3-marked chromatin is influenced by tensile, but not compressive, nuclear strains. Our findings highlight a new role for nuclear mechanosensation in guiding cell fate through chromatin reorganization in response to environmental cues.