Abstract Germ cells are the vehicle of human reproduction, arising early in embryonic development and developing throughout adult life until menopause onset in women. Primordial germ cells are the common precursors of germline cells in both sexes, undergoing sexual specification into oogonia or gonocytes which further develop into oocytes or spermatocytes during development. Methods for recapitulation of primordial germ cell and oogonia formation have been developed extensively in recent decades, but fundamental technical limitations in their methodologies, throughput, and yield limit their utilization. Recently, transcription factor (TF)-based methods for human primordial germ cell-like cell (hPGCLC) formation, mouse meiotic entry, and mouse oocyte maturation have demonstrated the feasibility of gene overexpression screening in identifying potent regulators of germ cell development. Here we screened 47 folliculogenesis-regulating TFs for their role in hPGCLC and oogonia formation, identifying DLX5, HHEX , and FIGLA whose individual overexpression enhances hPGCLC formation from hiPSCs. Additionally, we identify a set of three TFs, ZNF281, LHX8 , and SOHLH1 , whose combinatorial overexpression drives direct oogonia-like formation from hiPSCs in a four-day, feeder-free monolayer culture condition with additional feeder-free culture capabilities post-isolation. We characterize these TF-based germ cells via gene and protein expression analyses, and demonstrate their broad similarity to in vivo germ cells. Together, these results identify novel regulators of human germ cell development and establish new TF-based tools for human in vitro oogenesis research.

Abstract An in vitro model of human ovarian follicles would greatly benefit the study of female reproduction. Ovarian development requires the combination of germ cells and their supporting somatic cells, known as granulosa cells. Whereas efficient protocols exist for generating human primordial germ cell-like cells (hPGCLCs) from human iPSCs, a method of generating granulosa cells has been elusive. Here we report that simultaneous overexpression of two transcription factors (TFs) can direct the differentiation of human iPSCs to granulosa-like cells. We elucidate the regulatory effects of several granulosa-related TFs, and establish that overexpression of NR5A1 and either RUNX1 or RUNX2 is necessary and sufficient to generate granulosa-like cells. Our granulosa-like cells form ovary-like organoids (ovaroids) when aggregated with hPGCLCs, and recapitulate key ovarian phenotypes including support of germ cell maturation, follicle formation, and steroidogenesis. This model system will provide unique opportunities for studying human ovarian biology, and may enable the development of therapies for female reproductive health.

Abstract Demonstrating RNA catalysis within prebiotically relevant models of primordial cells (protocells) remains a challenge in Origins of life research. Fatty acid vesicles encapsulating genomic and catalytic RNAs (ribozymes) are attractive models for protocells; however, RNA catalysis has largely been incompatible with fatty acid vesicles due to their instability in the presence of Mg 2+ at concentrations required for ribozyme function. Here, we report a ribozyme that catalyzes template-directed RNA ligation at low Mg 2+ concentrations and thus remains active within stable vesicles. Ribose and adenine, both prebiotically relevant molecules, were found to greatly reduce Mg 2+ -induced RNA leakage from vesicles. When we co-encapsulated the ribozyme, substrate, and template within fatty acid vesicles, we observed efficient RNA-catalyzed RNA ligation upon subsequent addition of Mg 2+ . Our work shows that RNA-catalyzed RNA assembly can occur efficiently within prebiotically plausible fatty acid vesicles and represents a step toward the replication of primordial genomes within self-replicating protocells.

Structured Abstract Purpose To determine if rescue in vitro maturation (IVM) of human oocytes can be improved by co-culture with ovarian support cells (OSCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Methods Fertility patients undergoing conventional ovarian stimulation for oocyte cryopreservation or IVF donated denuded immature germinal vesicle (GV) and metaphase I (MI) oocytes for research, which were allocated between either the control or intervention cultures. Fertility patients aged 25 to 45 years old donated immature oocytes under informed consent, with no additional inclusion criteria. The 24-28 hour OSC-IVM culture condition was composed of 100,000 OSCs in suspension culture with human chorionic gonadotropin (hCG), recombinant follicle stimulating hormone (rFSH), androstenedione and doxycycline supplementation. The Media-IVM control lacked OSCs and contained the same supplementation. Primary endpoints consisted of MII formation rate and morphological quality assessment. Additionally, metaphase spindle assembly location and oocyte transcriptomic profiles were assessed compared to in vivo matured MII oocyte controls. Results We observed significant improvement in maturation outcome rates (∼1.7X) for oocytes that underwent IVM with OSCs. Specifically, the OSC-IVM group yielded a maturation rate of 62% ± 5.57% SEM versus 37% ± 8.96% SEM in the Media-IVM ( p =0.0138, unpaired t- test). Oocyte morphological quality between OSC-IVM and the Media-IVM control did not significantly differ. OSC-IVM resulted in MII oocytes with no instances of spindle absence and no significant difference in position compared to in vivo matured IVF-MII controls. OSC-IVM treated MII oocytes display a transcriptomic signature significantly more similar to IVF-MII controls than the Media-IVM control MII oocytes did. Conclusion The novel OSC-IVM platform is an effective tool for rescue maturation of human oocytes obtained from conventional stimulation cycles, yielding oocytes with improved nuclear and cytoplasmic maturation. OSC-IVM shows broad utility for application in modern fertility treatment to improve the total number of available mature oocytes for fertility treatment.

Determine if the gene expression profiles of ovarian support cells (OSCs) and cumulus-free oocytes are bidirectionally influenced by co-culture during in vitro maturation (IVM).

Abstract An in vitro model of human meiosis would accelerate research into this important reproductive process and development of therapies for infertility. We have developed a method to induce meiosis starting from male or female human pluripotent stem cells. We demonstrate that DNMT1 inhibition, retinoid signaling activation, and overexpression of regulatory factors (anti-apoptotic BCL2, and pro-meiotic HOXB5, BOLL, or MEIOC) rapidly activates meiosis, with leptonema beginning at 6 days, zygonema at 9 days, and pachynema at 12 days. Immunofluorescence microscopy shows key aspects of meiosis, including chromosome synapsis and sex body formation. The meiotic cells express genes similar to meiotic oogonia in vivo , including all synaptonemal complex components and machinery for meiotic recombination. These findings establish an accessible system for inducing human meiosis in vitro .

Over the last decade, advances in genome editing and pluripotent stem cell (PSC) culture have let researchers generate edited PSC lines to study a wide variety of biological questions. However, abnormalities in cell lines can arise during PSC culture or due to undesired editing outcomes. These can include aneuploidy, on-target and off-target editing errors, and microbial contamination. Any of these abnormalities can invalidate experiments, so detecting them is crucial. The ongoing decline of next-generation sequencing prices has made whole genome sequencing (WGS) an effective quality control option, since WGS can detect any abnormality involving changes to DNA sequences or presence of unwanted sequences. However, until now, this approach has suffered from a lack of easily usable data analysis software. Here, we present SeqVerify, a computational pipeline designed to take raw WGS data and a list of intended edits, and verify that the edits are present and that there are no abnormalities. We anticipate that SeqVerify will be a useful tool for researchers generating edited PSCs, and more broadly, for cell line quality control in general.

Abstract T-box riboswitches constitute a large family of tRNA-binding leader sequences that play a central role in gene regulation in many gram-positive bacteria. Accurate inference of the tRNA binding to T-boxes is critical to predict their cis-regulatory activity. However, there is no central repository of information on the tRNA binding specificities of T-box riboswitches and de novo prediction of binding specificities requires advance knowledge of computational tools to annotate riboswitch secondary structure features. Here we present T-box annotation D ata b ase ( TBDB, https://tbdb.io ), an open-access database with a collection of 23,497 T-box sequences, spanning the major phyla of 3,621 bacterial species. Among structural predictions, the TBDB also identifies specifier sequences, cognate tRNA binding partners, and downstream regulatory target. To our knowledge, the TBDB presents the largest collection of feature, sequence, and structural annotations carried out on this important family of regulatory RNA.

Abstract Assisted reproductive technologies (ART) have significantly impacted fertility treatment worldwide through innovations such as in vitro fertilization (IVF) and in vitro maturation (IVM). IVM holds promise as a technology for fertility treatment in women who cannot or do not wish to undergo conventional controlled ovarian stimulation (COS). However, IVM has historically shown highly variable performance in maturing oocytes and generating oocytes with strong developmental capacity. Furthermore, recently reported novel IVM approaches are limited to use in cycles lacking human chorionic gonadotropin (hCG) triggers, which is not standard practice in fertility treatment. We recently reported the development of ovarian support cells (OSCs) generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that recapitulate dynamic ovarian function in vitro . Here we investigate the potential of the se OSCs in an IVM co-culture system to improve the maturation of human cumulus-enclosed immature oocytes retrieved from abbreviated gonadotropin stimulated cycles. We reveal that OSC-IVM significantly improves maturation rates compared to existing IVM systems. Most importantly, we demonstrate that OSC-assisted IVM oocytes are capable of significantly improving euploid blastocyst formation and yielding blastocysts with normal global and germline differential methylation region methylation profiles, a key marker of their clinical utility. Together, these findings demonstrate a novel approach to IVM with broad applicability to modern ART practice. Structured Abstract Objective To determine if in vitro maturation (IVM) of human oocytes can be improved by co-culture with ovarian support cells (OSCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Design Three independent experiments were performed in which oocyte donors were recruited to undergo abbreviated gonadotropin stimulation and retrieved cumulus oocyte complexes (COCs) were randomly allocated between the OSC-IVM and control IVM conditions. Subjects Across the three experiments, a total of 67 oocyte donors aged 19 to 37 years were recruited for retrieval using informed consent. Anti-mullerian hormone (AMH) value, antral follicle count (AFC), age, BMI, and ovarian pathology were used for inclusion and exclusion criteria. Intervention and Control The OSC-IVM culture condition was composed of 100,000 OSCs in suspension culture supplemented with human chorionic gonadotropin (hCG), recombinant follicle stimulating hormone (rFSH), androstenedione and doxycycline. IVM controls comprised commercially-available IVM media without OSCs and contained either the same supplementation as above (media-matched control), or FSH and hCG only (IVM media control). In one experiment, an additional control using fetal ovarian somatic cells (FOSCs) was used with the same cell number and media conditions as in the OSC-IVM. Main Outcome Measures Primary endpoints consisted of metaphase II (MII) formation rate and oocyte morphological quality assessment. A limited cohort of oocytes were utilized for secondary endpoints, consisting of fertilization and blastocyst formation rates with preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) and embryo epigenetic analysis. Results OSC-IVM resulted in a statistically significant improvement in MII formation rate compared to the media-matched control, a commercially available IVM media control, and the FOSC-IVM control. Oocyte morphological quality between OSC-IVM and controls did not significantly differ. OSC-IVM displayed a trend towards improved fertilization, cleavage, and blastocyst formation. OSC-IVM showed statistically significant improvement in euploid day 5 or 6 blastocyst formation compared to the commercially available IVM media control. OSC-IVM embryos displayed similar epigenetic global and germline loci profiles compared to conventional stimulation and IVM embryos. Conclusion The novel OSC-IVM platform is an effective tool for maturation of human oocytes obtained from abbreviated gonadotropin stimulation cycles, supporting/inducing robust euploid blastocyst formation. OSC-IVM shows broad utility with different stimulation regimens, including hCG triggered and untriggered oocyte retrieval cycles, making it a highly useful tool for modern fertility treatment.