Abstract Much of the functional diversity observed in modern enzyme superfamilies originates from molecular tinkering with existing enzymes 1 . New enzymes frequently evolve from enzymes with latent, promiscuous activities 2 , and often inherit key features of the ancestral enzyme, retaining conserved catalytic groups and stabilizing analogous intermediates or transition states 3 . While experimental evolutionary biochemistry has yielded considerable insight into the evolution of new enzymes from existing enzymes 4 , the emergence of catalytic activity de novo remains poorly understood. Although certain enzymes are thought to have evolved from non-catalytic proteins 5–7 , the mechanisms underlying these complete evolutionary transitions have not been described. Here we show how the enzyme cyclohexadienyl dehydratase (CDT) evolved from a cationic amino acid-binding protein belonging to the solute-binding protein (SBP) superfamily. Analysis of the evolutionary trajectory between reconstructed ancestors and extant proteins showed that the emergence and optimization of catalytic activity involved several distinct processes. The emergence of CDT activity was potentiated by the incorporation of a desolvated general acid into the ancestral binding site, which provided an intrinsically reactive catalytic motif, and reshaping of the ancestral binding site, which facilitated enzyme-substrate complementarity. Catalytic activity was subsequently gained via the introduction of hydrogen-bonding networks that positioned the catalytic residue precisely and contributed to transition state stabilization. Finally, catalytic activity was enhanced by remote substitutions that refined the active site structure and reduced sampling of non-catalytic states. Our work shows that the evolutionary processes that underlie the emergence of enzymes by natural selection in the wild are mirrored by recent examples of computational design and directed evolution of enzymes in the laboratory.

Abstract SAR11 bacteria are the most abundant members of the global ocean microbiome and have a broad impact on ocean ecosystems. To thrive in their competitive oligotrophic environments, these bacteria rely on solute-binding proteins (SBPs) that facilitate nutrient uptake through ABC transporters. Nonetheless, previous studies have been unable to access the molecular mechanisms and functions of these transporters because they rely heavily on homology-based predictions. These mechanisms and functions are essential to understand biogeochemical cycling in the ocean, including assimilation of dissolved organic matter (DOM). Here, by doing a biochemical study of the collective behavior of all SBPs in a SAR11 bacterium, we discover that these transporters have unprecedented binding affinity ( K d ≥30 pM) and unexpectedly high binding specificity, revealing molecular mechanisms for oligotrophic adaptation. Our study uncovers new carbon sources for the SAR11 bacteria and provides an accurate biogeographical map of nutrient uptake in the ocean. Our results show how functional adaptation at the molecular level in ubiquitous marine bacteria impacts global patterns of DOM assimilation and provides insight into the contribution of different compounds to oceanic nutrient cycles.

Abstract The tRNA modification m 1 G37, which is introduced by the tRNA methyltransferase TrmD, is thought to be essential for growth in bacteria due to its role in suppressing translational frameshift errors at proline codons. However, because bacteria can tolerate high levels of mistranslation, it is unclear why loss of m 1 G37 is not tolerated. Here, we addressed this question by performing experimental evolution of trmD mutant strains of E. coli . Surprisingly, trmD mutant strains were viable even if the m 1 G37 modification was completely abolished, and showed rapid recovery of growth rate, mainly via tandem duplication or coding mutations in the proline-tRNA ligase gene proS . Growth assays and in vitro aminoacylation assays showed that G37-unmodified tRNA Pro is aminoacylated less efficiently than m 1 G37-modified tRNA Pro , and that growth of trmD mutant strains can be largely restored by single mutations in proS that restore aminoacylation of G37-unmodified tRNA Pro . These results show that inefficient aminoacylation of tRNA Pro is the main reason for growth defects observed in trmD mutant strains and that the ProRS enzyme may act as a gatekeeper of translational accuracy, preventing the use of error-prone unmodified tRNA Pro in protein translation. Our work shows the utility of experimental evolution for uncovering the hidden functions of essential genes and has implications for the development of antibiotics targeting TrmD.

Abstract m 6 A RNA methylation plays a key role in RNA processing and translational regulation, influencing both normal physiological and pathological processes. Yet, current techniques for studying RNA methylation struggle to isolate the effects of individual m 6 A modifications. Engineering of RNA methyltransferases (RNMTs) could enable development of improved synthetic biology tools to manipulate RNA methylation, but is challenging due to limited understanding of structure-function relationships in RNMTs. Herein, using ancestral sequence reconstruction we explore the sequence space of the bacterial DNA methyltransferase EcoGII (M.EcoGII), a promising target for protein engineering due to its lack of sequence specificity and its residual activity on RNA. We thereby created an efficient non-specific RNMT termed SUPREM, which exhibits 8-fold higher expression levels, 7 °C higher thermostability, and 12-fold greater m 6 A RNA methylation activity compared with M.EcoGII. Immunofluorescent staining confirmed SUPREM’s higher RNA methylation activity compared with M.EcoGII in mammalian cells. Additionally, Nanopore direct RNA sequencing highlighted that SUPREM is capable of methylating a larger number of RNA methylation sites than M.EcoGII. Through phylogenetic and mutational analysis, we identified a critical residue for the enhanced RNA methylation activity of SUPREM. Collectively, our findings indicate that SUPREM holds promise as a versatile tool for in vivo RNA methylation and labeling.

Resisting or tolerating microbes are alternative strategies to survive infection, but little is known about the evolutionary mechanisms controlling this balance. Here, genomic analyses of anatomically modern humans, extinct Denisovan hominins, and mice revealed a series of missense variants in the immune response inhibitor A20 (encoded by TNFAIP3), substituting non-catalytic residues of the ubiquitin protease domain to diminish IκB-dependent phosphorylation and activation of A20. Two A20 variants with partial phosphorylation deficits appeared beneficial: one originating in Denisovans and introgressed in modern humans throughout Oceania, and another in a mouse strain resistant to Coxsackievirus. By contrast, a variant with 95% loss of phosphorylation caused spontaneous inflammatory disease in humans and mice. Analysis of the partial phosphorylation variant in mice revealed diminished tolerance of bacterial lipopolysaccharide or to poxvirus inoculation as trade-offs for enhanced immunity.

Several enzymes are known to have evolved from non-catalytic proteins such as solute-binding proteins (SBPs). Although attention has been focused on how a binding site can evolve to become catalytic, an equally important question is: how do the structural dynamics of a binding protein change as it becomes an efficient enzyme? Here we performed a variety of experiments, including double electron-electron resonance (DEER), on reconstructed evolutionary intermediates to determine how the conformational sampling of a protein changes along an evolutionary trajectory linking an arginine SBP to a cyclohexadienyl dehydratase (CDT). We observed that primitive dehydratases predominantly populate catalytically unproductive conformations that are vestiges of their ancestral SBP function. Non-productive conformational states are frozen out of the conformational landscape via remote mutations, eventually leading to extant CDT that exclusively samples catalytically relevant compact states. These results show that remote mutations can reshape the global conformational landscape of an enzyme as a mechanism for increasing catalytic activity.

Abstract The emergence of oligomers is common during the evolution and diversification of protein families, yet the selective advantage of oligomerization is often cryptic or unclear. Oligomerization can involve the formation of isologous head-to-head interfaces (e.g., in symmetrical dimers) or heterologous head-to-tail interfaces (e.g., in cyclic complexes), the latter of which is less well studied and understood. In this work, we retrace the emergence of the trimeric form of cyclohexadienyl dehydratase from Pseudomonas aeruginosa (PaCDT) by introducing residues that form the PaCDT trimer-interface into AncCDT-5 (a monomeric reconstructed ancestor of PaCDT). We find that single interface mutations can switch the oligomeric state of the variants (implying evolutionarily metastable oligomeric states) and that trimerization corresponds with a reduction in the K M value of the enzyme from a promiscuous level to the physiologically relevant range. We show that this can be rationalized at the structural and dynamic level by reduced sampling of a non-catalytic conformational substate, and that trimerization was likely followed by a C-terminal extension that further refined the conformational sampling and kinetic properties of the enzyme. This work provides insight into how neutral sampling of metastable oligomeric states along an evolutionary trajectory can facilitate the evolution and optimization of enzyme function. Importance & Impact Statement Understanding how and why structural complexity (including homo-oligomerization and sequence insertions) emerges during the evolution and diversification of natural enzymes is a key goal in the study and design of protein function. We show that cyclic homo-oligomeric states can emerge via a small number of substitutions, and that trimerization and a C-terminal extension contributed to the tuning of catalytic properties during the evolution of cyclohexadienyl dehydratase from Pseudomonas aeruginosa .