Abstract Understanding how SARS-CoV-2 entered the human population, thereby causing the COVID-19 pandemic, is one of the most urgent questions in science today. Two hypotheses are widely acknowledged as being most likely to explain the pandemic’s origin in late 2019: (i) the “natural origin” hypothesis that one or more cross-species transmissions from animals into humans occurred, most likely at the Huanan Seafood Market in Wuhan, China; (ii) the “laboratory origin” hypothesis, that scientific research activities led to the unintentional leak of SARS-CoV-2 from a laboratory into the general population. A recent analysis of SARS-CoV-2 genomes by Pekar et al. [ Science 377 :960-966 (2022)] claims to establish at least two separate spillover events from animals into humans, thus claiming to provide strong evidence for the natural origin hypothesis. However, here we use outbreak simulations to show that the findings of Pekar et al. are heavily impacted by two methodological artifacts: the dubious exclusion of informative SARS-CoV-2 genomes, and their reliance on unrealistic phylodynamic models of SARS-CoV-2. Absent models that incorporate these effects, one cannot conclude multiple SARS-CoV-2 spillovers into humans. Our results cast doubt on a primary point of evidence in favor of the natural origin hypothesis. Lay Summary It is not known if SARS-CoV-2 spilled over from animals into humans at the Huanan Seafood Market, or arose as a result of research activities studying bat coronaviruses. Two recent papers had claimed to answer this question, but here we show those papers are both inconclusive as they fail to account for biases in how medical managers became alerted to SARS-CoV-2 and how public health authorities sampled early cases. Additionally, key data points conflicting with the authors’ conclusions were improperly excluded from the analysis. The papers’ methods do not justify their conclusions, and the origin of SARS-CoV-2 remains an urgent, open question for science.

HKU4-related coronaviruses are a group of betacoronaviruses belonging to the same merbecovirus subgenus as Middle Eastern Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV), which causes severe respiratory illness in humans with a mortality rate of over 30%. The high genetic similarity between HKU4-related coronaviruses and MERS-CoV makes them an attractive subject of research for modeling potential zoonotic spillover scenarios. In this study, we identify a novel coronavirus contaminating agricultural rice RNA sequencing datasets from Wuhan, China. The datasets were generated by the Huazhong Agricultural University in early 2020. We were able to assemble the complete viral genome sequence, which revealed that it is a novel HKU4-related merbecovirus. The assembled genome is 98.38% identical to the closest known full genome sequence, Tylonycteris pachypus bat isolate BtTp-GX2012. Using in silico modeling, we identified that the novel HKU4-related coronavirus spike protein likely binds to human dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), the receptor used by MERS-CoV. We further identified that the novel HKU4-related coronavirus genome has been inserted into a bacterial artificial chromosome in a format consistent with previously published coronavirus infectious clones. Additionally, we have found a near complete read coverage of the spike gene of the MERS-CoV reference strain HCoV-EMC/2012, and identify the likely presence of a HKU4-related-MERS chimera in the datasets. Our findings contribute to the knowledge of HKU4-related coronaviruses and document the use of a previously unpublished HKU4 reverse genetics system in apparent MERS-CoV related gain-of-function research. Our study also emphasizes the importance of improved biosafety protocols in sequencing centers and coronavirus research facilities.

Abstract HKU4-related coronaviruses (CoVs) are merbecoviruses related to Middle Eastern Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV). In 2022 and 2023, two HKU4-related CoV strains were discovered in Manis javanica (Malayan pangolin) metagenomic datasets derived from organ samples: HKU4-P251T and MjHKU4r-CoV-1. Together with the Tylonycteris robustula bat CoV 162275, which was discovered in 2022, pangolin CoVs HKU4-P251T and MjHKU4r-CoV-1 form a novel phylogenetic clade distinct from all previously documented HKU4-related CoVs. In this study, we identified a novel HKU4-related CoV in a pangolin single-cell sequencing dataset generated by BGI-Shenzhen in Shenzhen, Guangdong, China in 2020. The CoV phylogenetically belongs to the same newly identified clade. The single cell datasets were reported as generated from organ samples of a single pangolin that died of natural causes. 98% of the HKU4-related CoV reads were found in only one of the seven single cell datasets — a large intestine cell dataset, cells of which exhibit low expression of DPP4. Bacterial contamination was found to be moderately correlated with HKU4-related CoV presence. We further identified with high confidence that the RNA-Seq dataset supporting one of four near identical variants of MjHKU4r-CoV-1 is a Sus scrofa (wild pig) metagenomic dataset, with only a trace level of Manis javanica genomic content. The presence of HKU4-related CoV reads in the dataset are almost certainly laboratory research-related and not from a premortal pangolin or pig infection. Our findings raise concerns about the provenance of the novel HKU4-related CoV we identify here, MjHKU4r-CoV-1 and its four near-identical variants.