Repair of dsDNA breaks requires processing to produce 3'-terminated ssDNA. We biochemically reconstituted DNA end resection using purified human proteins: Bloom helicase (BLM); DNA2 helicase/nuclease; Exonuclease 1 (EXO1); the complex comprising MRE11, RAD50, and NBS1 (MRN); and Replication protein A (RPA). Resection occurs via two routes. In one, BLM and DNA2 physically and specifically interact to resect DNA in a process that is ATP-dependent and requires BLM helicase and DNA2 nuclease functions. RPA is essential for both DNA unwinding by BLM and enforcing 5' → 3' resection polarity by DNA2. MRN accelerates processing by recruiting BLM to the end. In the other, EXO1 resects the DNA and is stimulated by BLM, MRN, and RPA. BLM increases the affinity of EXO1 for ends, and MRN recruits and enhances the processivity of EXO1. Our results establish two of the core machineries that initiate recombinational DNA repair in human cells.

MRE11 within the MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex acts in DNA double-strand break repair (DSBR), detection, and signaling; yet, how its endo- and exonuclease activities regulate DSBR by nonhomologous end-joining (NHEJ) versus homologous recombination (HR) remains enigmatic. Here, we employed structure-based design with a focused chemical library to discover specific MRE11 endo- or exonuclease inhibitors. With these inhibitors, we examined repair pathway choice at DSBs generated in G2 following radiation exposure. While nuclease inhibition impairs radiation-induced replication protein A (RPA) chromatin binding, suggesting diminished resection, the inhibitors surprisingly direct different repair outcomes. Endonuclease inhibition promotes NHEJ in lieu of HR, while exonuclease inhibition confers a repair defect. Collectively, the results describe nuclease-specific MRE11 inhibitors, define distinct nuclease roles in DSB repair, and support a mechanism whereby MRE11 endonuclease initiates resection, thereby licensing HR followed by MRE11 exonuclease and EXO1/BLM bidirectional resection toward and away from the DNA end, which commits to HR.

The human Rad50 protein, classified as a structural maintenance of chromosomes (SMC) family member, is complexed with Mre11 (R/M) and has important functions in at least two distinct double-strand break repair pathways. To find out what the common function of R/M in these pathways might be, we investigated its architecture. Scanning force microscopy showed that the complex architecture is distinct from the described SMC family members. R/M consisted of two highly flexible intramolecular coiled coils emanating from a central globular DNA binding domain. DNA end-bound R/M oligomers could tether linear DNA molecules. These observations suggest that a unified role for R/M in multiple aspects of DNA repair and chromosome metabolism is to provide a flexible, possibly dynamic, link between DNA ends.

ABSTRACT In meiotic homologous recombination (HR), BRCA2 facilitates loading of the recombinases RAD51 and DMC1 at the sites of double-strand breaks. The HSF2BP-BRME1 complex interacts with BRCA2 to support its function in meiotic HR. In somatic cancer cells ectopically producing HSF2BP, DNA damage can trigger HSF2BP-dependent degradation of BRCA2, which prevents HR. Here we show that, upon binding to BRCA2, HSF2BP assembles into a large ring-shaped 24-mer consisting of three interlocked octameric rings. Addition of BRME1 leads to dissociation of this ring structure, and cancels the disruptive effect of HSF2BP on cancer cell resistance to DNA damage. It also prevents BRCA2 degradation during inter-strand DNA crosslink repair in Xenopus egg extracts. We propose that the control of HSF2BP-BRCA2 oligomerization by BRME1 ensures timely assembly of the ring complex that concentrates BRCA2 and controls its turnover, thus promoting meiotic HR.

ABSTRACT BRCA2 is an essential tumor suppressor protein involved in promoting faithful repair of DNA lesions. The activity of BRCA2 needs to be tuned precisely to be active when and where it is needed. Here, we quantified the spatio-temporal dynamics of BRCA2 in living cells using aberration-corrected multifocal microscopy (acMFM). Using multicolor imaging to identify DNA damage sites, we were able to quantify its dynamic motion patterns in the nucleus and at DNA damage sites. While a large fraction of BRCA2 molecules localized near DNA damage sites appear immobile, an additional fraction of molecules exhibits subdiffusive motion, providing a potential mechanism to retain an increased number of molecules at DNA lesions. Super-resolution microscopy revealed inhomogeneous localization of BRCA2 relative to other DNA repair factors at sites of DNA damage. This suggests the presence of multiple nanoscale compartments in the chromatin surrounding the DNA lesion, which could play an important role in the contribution of BRCA2 to the regulation of the repair process.

Abstract BRCA2 is an essential protein in genome maintenance, homologous recombination and replication fork protection. Its function includes multiple interaction partners and requires timely localization to relevant sites in the nucleus. We investigated the importance of the highly conserved DNA binding domain (DBD) and C-terminal domain (CTD) of BRCA2. We generated BRCA2 variants missing one or both domains in mouse ES cells and defined their contribution in HR function and dynamic localization in the nucleus, by single particle tracking of BRCA2 mobility. Changes in molecular architecture of BRCA2 induced by binding partners of purified BRCA2 was determined by scanning force microscopy. BRCA2 mobility and DNA damage-induced increase in the immobile fraction was largely unaffected by C- terminal deletions. The purified proteins missing CTD and/or DBD were defective in architectural changes correlating with reduced homologous recombination function in cells. These results emphasize BRCA2 activity at sites of damage beyond promoting RAD51 delivery.

The tumor suppressor BRCA2 is essential for homologous recombination, replication fork stability and DNA interstrand crosslink (ICL) repair in vertebrates. We show that a functionally uncharacterized protein, HSF2BP, is involved in a novel, direct and highly evolutionarily conserved interaction with BRCA2. Although HSF2BP was previously described as testis-specific, we find it is expressed in mouse ES cells, in human cancer cell lines, and in tumor samples. Elevated levels of HSF2BP sensitize human cells to ICL-inducing agents (mitomycin C and cisplatin) and PARP inhibitors, resulting in a phenotype characteristic of cells from Fanconi anemia (FA) patients. We biochemically recapitulate the suppression of ICL repair and establish that excess HSF2BP specifically compromises homologous recombination by preventing BRCA2 and RAD51 loading at the ICL. As increased ectopic expression of HSF2BP occurs naturally, we suggest that it can be considered as a causative agent in FA and a source of cancer-promoting genomic instability.