ABSTRACT Pathogenic variants in neuronal voltage-gated sodium (Na V ) channel genes including SCN2A , which encodes Na V 1.2, are frequently discovered in neurodevelopmental disorders with and without epilepsy. SCN2A is also a high confidence risk gene for autism spectrum disorder (ASD) and nonsyndromic intellectual disability (ID). Previous work to determine the functional consequences of SCN2A variants yielded a paradigm in which predominantly gain-of-function (GoF) variants cause epilepsy whereas loss-of-function (LoF) variants are associated with ASD and ID. However, this framework is based on a limited number of functional studies conducted under heterogenous experimental conditions whereas most disease-associated SCN2A variants have not been functionally annotated. We determined the functional properties of more than 30 SCN2A variants using automated patch clamp recording to assess the analytical validity of this approach and to examine whether a binary classification of variant dysfunction is evident in a larger cohort studied under uniform conditions. We studied 28 disease-associated variants and 4 common population variants using two distinct alternatively spliced forms of Na V 1.2 that were heterologously expressed in HEK293T cells. Multiple biophysical parameters were assessed on 5,858 individual cells. We found that automated patch clamp recording provided a valid high throughput method to ascertain detailed functional properties of Na V 1.2 variants with concordant findings for a subset of variants that were previously studied using manual patch clamp. Additionally, many epilepsy-associated variants in our study exhibited complex patterns of gain- and loss-of-function properties that are difficult to classify overall by a simple binary scheme. The higher throughput achievable with automated patch clamp enables study of a larger number of variants, greater standardization of recording conditions, freedom from operator bias, and enhanced experimental rigor valuable for accurate assessment of Na V channel variant dysfunction. Together, this approach will enhance our ability to discern relationships between variant channel dysfunction and neurodevelopmental disorders.

The reprogramming of somatic cells to a spontaneously contracting cardiomyocyte-like state using defined transcription factors has proven successful in mouse fibroblasts. However, this process has been less successful in human cells, thus limiting the potential clinical applicability of this technology in regenerative medicine. We hypothesized that this issue is due to a lack of cross-species concordance between the required transcription factor combinations for mouse and human cells. To address this issue, we identified novel transcription factor candidates to induce cell conversion between human fibroblasts and cardiomyocytes, using the network-based algorithm Mogrify. We developed an automated, high-throughput method for screening transcription factor, small molecule, and growth factor combinations, utilizing acoustic liquid handling and high-content kinetic imaging cytometry. Using this high-throughput platform, we screened the effect of 4,960 unique transcription factor combinations on direct conversion of 24 patient-specific primary human cardiac fibroblast samples to cardiomyocytes. Our screen revealed the combination of MYOCD , SMAD6 , and TBX20 (MST) as the most successful direct reprogramming combination, which consistently produced up to 40% TNNT2 + cells in just 25 days. Addition of FGF2 and XAV939 to the MST cocktail resulted in reprogrammed cells with spontaneous contraction and cardiomyocyte-like calcium transients. Gene expression profiling of the reprogrammed cells also revealed the expression of cardiomyocyte associated genes. Together, these findings indicate that cardiac direct reprogramming in human cells can be achieved at similar levels to those attained in mouse fibroblasts. This progress represents a step forward towards the clinical application of the cardiac direct reprogramming approach.Using network-based algorithm Mogrify, acoustic liquid handling, and high-content kinetic imaging cytometry we screened the effect of 4,960 unique transcription factor combinations. Using 24 patient-specific human fibroblast samples we identified the combination of MYOCD , SMAD6 , and TBX20 (MST) as the most successful direct reprogramming combination. MST cocktail results in reprogrammed cells with spontaneous contraction, cardiomyocyte-like calcium transients, and expression of cardiomyocyte associated genes.

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) culture has become routine, yet pluripotent cell media costs, frequent media changes, and reproducibility of differentiation have remained restrictive, limiting the potential for large-scale projects. Here, we describe the formulation of a novel hiPSC culture medium (B8) as a result of the exhaustive optimization of medium constituents and concentrations, establishing the necessity and relative contributions of each component to the pluripotent state and cell proliferation. B8 eliminates 97% of the costs of commercial media, made possible primarily by the in-lab generation of three E. coli -expressed, codon-optimized recombinant proteins: an engineered form of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with improved thermostability (FGF2-G3); transforming growth factor β3 (TGFβ3) - a more potent TGFβ able to be expressed in E. coli ; and a derivative of neuregulin 1 (NRG1) containing the EGF-like domain. The B8 formula is specifically optimized for fast growth and robustness at low seeding densities. We demonstrated the derivation and culture of 34 hiPSC lines in B8 as well as maintenance of pluripotency long-term (over 100 passages). This formula also allows a weekend-free feeding schedule without sacrificing growth rate or capacity for differentiation. Thus, this simple, cost-effective, and open source B8 media, will enable large hiPSC disease modeling projects such as those being performed in pharmacogenomics and large-scale cell production required for regenerative medicine.

Objective : We identified a novel de novo SCN2A variant (M1879T) associated with infantile-onset epilepsy that responded dramatically to sodium channel blocker antiepileptic drugs. We analyzed the functional and pharmacological consequences of this variant to establish pathogenicity, and to correlate genotype with phenotype and clinical drug response. Methods : The clinical and genetic features of an infant boy with epilepsy are presented. We investigated the effect of the variant using heterologously expressed recombinant human NaV1.2 channels. We performed whole-cell patch clamp recording to determine the functional consequences and response to carbamazepine. Results : The M1879T variant caused disturbances in channel inactivation including substantially depolarized voltage-dependence of inactivation, slower time course of inactivation, and enhanced resurgent current that collectively represent a gain-of-function. Carbamazepine partially normalized the voltage-dependence of inactivation and produced use-dependent block of the variant channel at high pulsing frequencies. Carbamazepine also suppresses resurgent current conducted by M1879T channels, but this effect was explained primarily by reducing the peak transient current. Molecular modeling suggests that the M1879T variant disrupts contacts with nearby residues in the C-terminal domain of the channel. Interpretation : Our study demonstrates the value of conducting functional analyses of SCN2A variants of unknown significance to establish pathogenicity and genotype-phenotype correlations. We also show concordance of in vitro pharmacology using heterologous cells with the drug response observed clinically in a case of SCN2A-associated epilepsy.

Pathogenic variants in SCN8A , which encodes the voltage-gated sodium (Na V ) channel Na V 1.6, are associated with neurodevelopmental disorders including epileptic encephalopathy. Previous approaches to determine SCN8A variant function may be confounded by the use of a neonatal-expressed alternatively spliced isoform of Na V 1.6 (Na V 1.6N), and engineered mutations to render the channel tetrodotoxin (TTX) resistant. In this study, we investigated the impact of SCN8A alternative splicing on variant function by comparing the functional attributes of 15 variants expressed in two developmentally regulated splice isoforms (Na V 1.6N, Na V 1.6A). We employed automated patch clamp recording to enhance throughput, and developed a novel neuronal cell line (ND7/LoNav) with low levels of endogenous Na V current to obviate the need for TTX-resistance mutations. Expression of Na V 1.6N or Na V 1.6A in ND7/LoNav cells generated Na V currents that differed significantly in voltage-dependence of activation and inactivation. TTX-resistant versions of both isoforms exhibited significant functional differences compared to the corresponding wild-type (WT) channels. We demonstrated that many of the 15 disease-associated variants studied exhibited isoform-dependent functional effects, and that many of the studied SCN8A variants exhibited functional properties that were not easily classified as either gain- or loss-of-function. Our work illustrates the value of considering molecular and cellular context when investigating SCN8A variants.

Pathogenic variants in ATP1A3 encoding the neuronal Na/K-ATPase cause a spectrum of neurodevelopmental disorders including alternating hemiplegia of childhood (AHC). Three recurrent ATP1A3 variants are associated with approximately half of known AHC cases and mouse models of two of these variants (p.D801N, p.E815K) replicated key features of the human disorder, which include paroxysmal hemiplegia, dystonia and seizures. Epilepsy occurs in 40-50% of individuals affected with AHC, but detailed investigations of seizure phenotypes were limited in the previously reported mouse models. Using gene editing, we generated a novel AHC mouse expressing the third most recurrent ATP1A3 variant (p.G947R) to model neurological phenotypes of the disorder. Heterozygous Atp1a3-G947R mice on a pure C57BL/6J background were born at a significantly lower frequency than wildtype (WT) littermates, but in vitro fertilization or outcrossing to a different strain (C3HeB/FeJ) generated offspring at near-Mendelian genotype ratios, suggesting a defect in reproductive fitness rather than embryonic lethality. Heterozygous mutant mice were noticeably smaller and exhibited premature lethality, hyperactivity, anxiety-like behaviors, severe motor dysfunction including low grip strength, impaired coordination with abnormal gait and balance, and cooling-induced hemiplegia and dystonia. We also observed a prominent seizure phenotype with lower thresholds to chemically (flurothyl, kainic acid) and electrically induced seizures, post-handling seizures, sudden death following seizures, and abnormal EEG activity. Together, our findings support face validity of a novel AHC mouse model with quantifiable traits including co-morbid epilepsy that will be useful as an in vivo platform for investigating pathophysiology and testing new therapeutic strategies for this rare neurodevelopmental disorder.

The explosive growth in known human gene variation presents enormous challenges to current approaches for variant classification that impact diagnosis and treatment of many genetic diseases. For disorders caused by mutations in cardiac ion channels, such as congenital long-QT syndrome (LQTS), in vitro electrophysiological evidence has high value in discriminating pathogenic from benign variants, but these data are often lacking because assays are cost-, time- and labor-intensive. We implemented a strategy for performing high throughput, functional evaluations of ion channel variants that repurposed an automated electrophysiology platform developed previously for drug discovery. We demonstrated success of this approach by evaluating 78 variants in KCNQ1, a major LQTS gene. We benchmarked our results with traditional electrophysiological approaches and observed a high level of concordance. Our results provided functional data useful for classifying ~70% of previously unstudied KCNQ1 variants annotated with uninformative descriptions in the public database ClinVar. Further, we show that rare and ultra-rare KCNQ1 variants in the general population exhibit functional properties ranging from normal to severe loss-of-function indicating that allele frequency is not a reliable predictor of channel function. Our results illustrate an efficient and high throughput paradigm linking genotype to function for a human cardiac channelopathy that will enable data-driven classification of large numbers of variants and create new opportunities for precision medicine.

ABSTRACT Mutations in genes encoding the human brain-expressed voltage-gated sodium (Na V ) channels Na V 1.1, Na V 1.2, and Na V 1.6 are associated with a variety of human diseases including epilepsy, autism spectrum disorder, familial migraine, and other neurodevelopmental disorders. A major obstacle hindering investigations of the functional consequences of brain Na V channel mutations is an unexplained instability of the corresponding recombinant complementary DNA (cDNA) when propagated in commonly used bacterial strains manifested by high spontaneous rates of mutation. Here we investigated the cause for instability of human Na V 1.1 cDNA. We identified cryptic prokaryotic promoter-like elements that are presumed to drive transcription of translationally toxic mRNAs in bacteria as the cause of the instability, and demonstrated that mutations in these elements can mitigate the instability. Extending these observations, we generated full-length human Na V 1.1, Na V 1.2, and Na V 1.6 plasmids using one or two introns that interrupt the cryptic reading frames along with a minimum number of silent nucleotide changes that achieved stable propagation in bacteria. Expression of the stabilized sequences in cultured mammalian cells resulted in functional Na V channels with properties that matched their parental constructs. Our findings explain a widely observed instability of recombinant neuronal human Na V channels, and we describe re-engineered plasmids that attenuate this problem.