Abstract Assembly of the hair bundle, the sensory organelle of the inner ear, depends on differential growth of actin-based stereocilia. Separate rows of stereocilia, labeled 1 through 3 from tallest to shortest, lengthen or shorten during discrete time intervals during development. We used lattice structured illumination microscopy and surface rendering of mouse apical inner hair cells to measure stereocilia dimensions during early postnatal development; these measurements revealed a sharp transition at postnatal day 8 between stage III (row 1 and 2 widening; row 2 shortening) and stage IV (final row 1 lengthening and widening). Tip proteins that determine row 1 lengthening did not accumulate simultaneously during stages III and IV; while the actin-bundling protein EPS8 peaked at the end of stage III, GNAI3 peaked several days later—in early stage IV—and GPSM2 peaked near the end of stage IV. To establish the contributions of key macromolecular assemblies to bundle structure, we examined mouse mutants that eliminated tip links ( Cdh23 v2J or Pcdh15 av3J ), transduction channels ( Tmie KO ), or the row 1 tip complex ( Myo15a sh2 ). Cdh23 v2J/v2J and Pcdh15 av3J/av3J bundles had adjacent stereocilia in the same row that were not matched in length, revealing that a major role of these cadherins is to synchronize lengths of side-by-side stereocilia. Use of the tip-link mutants also allowed us to distinguish the role of transduction from effects of transduction proteins themselves. While levels of GNAI3 and GPSM2, which stimulate stereocilia elongation, were greatly attenuated at the tips of Tmie KO/KO row 1 stereocilia, they accumulated normally in Cdh23 v2J/v2J and Pcdh15 av3J/av3J stereocilia. These results reinforced the suggestion that the transduction proteins themselves facilitate localization of proteins in the row 1 complex. By contrast, EPS8 concentrates at tips of all Tmie KO/KO , Cdh23 v2J/v2J and Pcdh15 av3J/av3J stereocilia, correlating with the less polarized distribution of stereocilia lengths in these bundles. These latter results indicated that in wild-type hair cells, the transduction complex prevents accumulation of EPS8 at the tips of shorter stereocilia, causing them to shrink (row 2 and 3) or disappear (row 4 and microvilli). Reduced rhodamine-actin labeling at row 2 stereocilia tips of tip-link and transduction mutants suggests that transduction’s role is to destabilize actin filaments there. These results suggest that regulation of stereocilia length occurs through EPS8, and that CDH23 and PCDH15 regulate stereocilia lengthening beyond their role in gating mechanotransduction channels.

GIPC3 has been implicated in auditory function. Initially localized to the cytoplasm of inner and outer hair cells of the cochlea, GIPC3 increasingly concentrated in cuticular plates and at cell junctions during postnatal development. Early postnatal Gipc3 KO/KO mice had mostly normal mechanotransduction currents, but had no auditory brainstem response at one month of age. Cuticular plates of Gipc3 KO/KO hair cells did not flatten during development as did those of controls; moreover, hair bundles were squeezed along the cochlear axis in mutant hair cells. Junctions between inner hair cells and adjacent inner phalangeal cells were also severely disrupted in Gipc3 KO/KO cochleas. GIPC3 bound directly to MYO6, and the loss of MYO6 led to altered distribution of GIPC3. Immunoaffinity purification of GIPC3 from chicken inner ear extracts identified co-precipitating proteins associated with adherens junctions, intermediate filament networks, and the cuticular plate. Several of immunoprecipitated proteins contained GIPC-family consensus PDZ binding motifs (PBMs), including MYO18A, which binds directly to the PDZ domain of GIPC3. We propose that GIPC3 and MYO6 couple to PBMs of cytoskeletal and cell-junction proteins to shape the cuticular plate.The PDZ-domain protein GIPC3 couples the molecular motors MYO6 and MYO18A to actin cytoskeleton structures in hair cells. GIPC3 is necessary for shaping the hair cell’s cuticular plate and hence the arrangement of the stereocilia in the hair bundle.

Actin-rich structures like stereocilia and microvilli are assembled with precise control of length, diameter, and relative spacing. We found that developmental widening of the second-tallest stereocilia rank (row 2) of mouse inner hair cells correlated with the appearance of mechanotransduction. Correspondingly, Tmc1^KO/KO;Tmc2^KO/KO or Tmie^KO/KO hair cells, which lack transduction, have significantly altered stereocilia lengths and diameters. EPS8 and the short splice isoform of MYO15A, identity markers for row 1 (tallest), lost their row exclusivity in transduction mutants, a result that was mimicked by block of transduction channels. Likewise, the heterodimeric capping protein subunit CAPZB and its partner TWF2 lost their row 2 tip localization in mutants, and GNAI3 failed to accumulate at row 1 tips. Redistribution of marker proteins was accompanied by increased variability in stereocilia height. Transduction channels thus specify and maintain row identity and control addition of new actin filaments to increase stereocilia diameter.

Abstract Strategies to reveal the discovery of the relationships between novel phenotypic behaviors and specific genetic alterations can be achieved via either target-specific, directed mutagenesis or phenotypic selection following random chemical mutagenesis. As an alternative approach, one can exploit deficiencies in DNA repair pathways that are responsible for the maintenance of genetic integrity in response to spontaneously-induced damage. In the genetic background of mice deficient in the DNA glycosylase NEIL1, elevated numbers of spontaneous mutations arise from translesion DNA synthesis past unrepaired, oxidatively-induced base damage. Several litters of Neil1 knockout mice included animals that were distinguished by their backwards-walking behavior in open-field environments, while maintaining frantic forward movements in their home cage environment. Other phenotypic manifestations included swim test failures, head tilting, and circling. Mapping of the mutation that conferred these behaviors revealed the introduction of a stop codon at amino acid 4 of the Ush1g gene; the allele was Ush1g bw , reflecting the backwards-walking phenotype. Ush1g bw/bw null mice displayed auditory and vestibular defects that are commonly seen with mutations affecting inner-ear hair-cell function, including a complete lack of auditory brainstem responses and vestibular-evoked potentials. As in other Usher syndrome type I mutant mouse lines, hair-cell phenotypes included disorganized and split hair bundles, as well as altered distribution of proteins for stereocilia that localize to the tips of row 1 or row 2. Disruption to the bundle and kinocilium displacement suggested that USH1G is essential for forming the hair cell’s kinocilial links. Due to the vestibular dysfunction, however, visual behavior as measured with optokinetic tracking could not be assessed in Ush1g bw/bw mice. Consistent with other Usher type 1 models, however, Ush1g bw/bw mice had no substantial retinal degeneration compared to Ush1g bw /+ controls out to six months. In contrast to previously-described Ush1g alleles, this new allele provides the first knockout model for this gene.