Metabolic alterations in cancer precipitate in associated dependencies that can be therapeutically exploited. To meet this goal, natural product-inspired small molecules can provide a resource of invaluable chemotypes. Here, we identify orpinolide, a synthetic withanolide analog with pronounced antileukemic properties, via orthogonal chemical screening. Through multiomics profiling and genome-scale CRISPR-Cas9 screens, we identify that orpinolide disrupts Golgi homeostasis via a mechanism that requires active phosphatidylinositol 4-phosphate signaling at the endoplasmic reticulum-Golgi membrane interface. Thermal proteome profiling and genetic validation studies reveal the oxysterol-binding protein OSBP as the direct and phenotypically relevant target of orpinolide. Collectively, these data reaffirm sterol transport as a therapeutically actionable dependency in leukemia and motivate ensuing translational investigation via the probe-like compound orpinolide.

Abstract Sterol-binding proteins are important regulators of lipid homeostasis and membrane integrity; however, the discovery of selective small molecule modulators can be challenging due to structural similarities in the sterol binding domains. We report the discovery of highly potent and selective inhibitors of oxysterol binding protein (OSBP), which we term oxybipins . Sterol-containing chemical chimeras aimed at identifying new sterol binding proteins by targeted degradation, led to a significant reduction in Golgi-associated proteins. The degradation was found to occur at lysosomes, concomitant with changes in general protein glycosylation, indicating that the degradation of Golgi proteins was a downstream effect. By establishing a sterol transport protein biophysical assay panel, we discovered that the oxybipins potently inhibited OSBP, resulting in blockage of retrograde trafficking and attenuating Shiga toxin toxicity. As the oxybipins do not target any other sterol transporters tested, we advocate their use as chemical tools to study OSBP function and therapeutic relevance.

ABSTRACT Sterol transport proteins (STPs) play a pivotal role in cholesterol homeostasis and therefore are essential for healthy human physiology. Despite recent advances in dissecting functions of STPs in the human cell, there is still a significant knowledge gap regarding their specific biological functions and a lack of suitable selective probes for their study. Here, we profile fluorescent steroid-based probes across ten STPs, uncovering substantial differences in their selectivity, aiding the retrospective and prospective interpretation of biological results generated with those probes. These results guided the establishment of an STP screening panel combining diverse biophysical assays, enabling the evaluation of 41 steroid-based natural products and derivatives. Combining this with a thorough structural analysis revealed the molecular basis for STP specific selectivity profiles, leading to the uncovering of several new potent and selective Aster-B inhibitors, and supporting the role of this protein in steroidogenesis.

Abstract Graphical abstract Squalene synthase (SQS) is an essential enzyme in the mevalonate pathway whose abundance and activity control cholesterol biosynthesis and homeostasis. Although catalytic inhibitors of SQS have been developed to attenuate cholesterol, none so far have been approved for therapeutic use. Herein we sought to develop SQS degraders using targeted protein degradation (TPD) as an approach to lower overall cellular cholesterol content. We found that KY02111, a small molecule ligand of SQS, could selectively cause SQS to degrade in a proteasome-dependent manner. In contrast, compounds based on the same scaffold linked to E3 ligase recruiting ligands led to SQS stabilization. Whole cell proteomic analysis found KY02111 to reduce only the levels of SQS, while lipidomic analysis determined that KY02111 treatment concomitantly reduced cellular cholesteryl ester content. SQS stabilizers were shown to shield SQS from its natural turnover without recruiting their matching E3 ligase. Our work shows that degradation of SQS is possible despite a challenging biological setting and lays the groundwork for future development of either SQS degrading or stabilizing probes.

Abstract Metabolic alterations in cancer precipitate in associated dependencies that can be therapeutically exploited. To meet this goal, natural product inspired small molecules can provide a resource of invaluable chemotypes. Here, we identify orpinolide, a synthetic withanolide analog with pronounced anti-leukemic properties via orthogonal chemical screening. Through multi-omics profiling and genome-scale CRISPR/Cas9 screens, we identify that orpinolide disrupts Golgi homeostasis via a mechanism that requires active phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) signaling at the endoplasmic reticulum (ER)-Golgi membrane interface. Thermal proteome profiling and genetic validation studies reveal the oxysterol-binding protein OSBP as the direct and phenotypically relevant target of orpinolide. Collectively, these data reaffirm sterol transport as a therapeutically actionable dependency in leukemia and motivate ensuing translational investigation via the probe-like compound orpinolide.