Abstract PhoP-PhoR empowers M. tuberculosis to adapt to diverse environmental conditions, and remains essential for virulence. Although PhoP and PhoR have been structurally characterized, the signal(s) that this TCS responds to remains unknown. In this study, we show that PhoR is a sensor of acidic pH/high salt conditions, which activate PhoP via phosphorylation. Transcriptomic studies uncover that acidic pH-inducible expression of PhoP regulon is significantly inhibited in a PhoR-deleted M. tuberculosis . Using genome-wide screening we further identify a non-canonical mechanism of PhoP phosphorylation by the sensor kinase PrrB. To investigate how phosphorylation of PhoP is regulated, we discovered that PhoR functions as a phosphatase. Our results identify the motif/residues responsible for contrasting kinase/phosphatase dual functioning of PhoP, and collectively determine the homeostatic regulation of intra-mycobacterial P~PhoP which controls the final output of PhoP regulon. Together, these data uncover that PhoR plays a central role in mycobacterial adaptation to low pH conditions within the host macrophage phagosome. Consistent with these results a PhoR-deleted M. tuberculosis remains significantly attenuated in macrophages and animal models.

Abstract Survival of M. tuberculosis within the host macrophages requires the bacterial virulence regulator PhoP, but the underlying reason remains unknown. cAMP is one of the most widely used second messengers, which impacts on a wide range of cellular responses in microbial pathogens including M. tuberculosis . Herein, we hypothesized that intra-bacterial cAMP level could be controlled by PhoP since this major regulator plays a key role in bacterial responses against numerous stress conditions. A transcriptomic analysis reveals that PhoP functions as a repressor of cAMP-specific phosphodiesterase (PDE) Rv0805, which hydrolyses cAMP. In keeping with these results, we find specific recruitment of the regulator within the promoter region of rv0805 PDE, and absence of phoP or ectopic expression of rv0805 independently accounts for elevated PDE synthesis leading to depletion of intra-bacterial cAMP level. Thus, genetic manipulation to inactivate PhoP- rv0805 -cAMP pathway decreases cAMP level, stress tolerance and intracellular survival of the bacillus.

Abstract Cyclic AMP (cAMP) is known to function as a global regulator of M. tuberculosis gene expression. Sequence-based transcriptomic profiling identified the mycobacterial regulon controlled by the cAMP receptor protein, CRP. In this study, we identified a new subset of CRP-associated genes including virulence determinants which are also under the control of a major regulator, PhoP. Our results suggest that PhoP as a DNA binding transcription factor, impacts expression of these genes, and phosphorylated PhoP promotes CRP recruitment at the target promoters. Further, we uncover a distinct regulatory mechanism involving CRP and PhoP on transcriptional control of these genes. While both these regulators influence gene expression, we show that activation of these genes requires direct recruitment of both PhoP and CRP at their target promoters. The most fundamental biological insight is derived from the inhibition of CRP binding at the regulatory regions in a PhoP-deleted strain owing to CRP-PhoP protein-protein interactions. Based on these results, a model is proposed suggesting how CRP and PhoP function as co-activators and contribute to activation of the essential pathogenic determinants. Together, these results uncover a novel mechanism where two interacting virulence factors impact expression of virulence determinants, have significant implications on TB pathogenesis.

Abstract The main purpose of this study is to understand how mycobacteria can sense numerous stress conditions and mount an appropriate stress response. Recent studies suggest that at low pH M. tuberculosis encounters reductive stress, and in response, modulates redox homeostasis by utilizing the phoPR regulatory system. However, the mechanism of integrated regulation of stress response remains unknown. To probe how PhoP contributes to redox stress response, we find that a PhoP-depleted M. tuberculosis shows a significantly enhanced susceptibility to redox stress relative to the WT bacilli. In keeping with these results, PhoP was shown to contribute to mycothiol redox state. Because SigH, one of the alternative sigma factors of mycobacteria, is known to control expression of redox inducible genes, we probed whether previously-reported PhoP-SigH interaction accounts for mycobacterial redox stress response. We had shown that under acidic conditions PhoP functions in maintaining pH homeostasis via its interaction with SigE. In striking contrast, here we show that under redox stress, direct recruitment of SigH, but not PhoP-SigH interaction, controls expression of mycobacterial thioredoxin genes, a major mycobacterial anti-oxidant system. Together, these unexpected results uncover novel stress-specific enhanced or reduced interaction events of sigma factors and PhoP, as the underlying mechanisms of an adaptive programme, which couples low pH conditions and mycobacterial thiol redox homeostasis. Significance M. tuberculosis encounters reductive stress under acidic pH. To investigate the mechanism of integrated stress response, we show that PhoP plays a major role in mycobacterial redox stress response. We observed a significant correlation between phoP -dependent and redox-active expression of thioredoxin genes, a major mycobacterial antioxidant system. Further probing on functioning of regulators reveals that while PhoP controls pH homeostasis via its interaction with SigE, direct recruitment of SigH, but not PhoP-SigH interaction, controls expression of thioredoxin genes. These strikingly contrasting results showing enhanced PhoP-SigE interaction under acidic pH and reduced PhoP-SigH interaction under redox conditions, uncover the underlying novel mechanism of mycobacterial adaptive program, coupling low pH with maintenance of redox homeostasis.