Abstract Purpose: Advanced-stage epithelial ovarian cancer has a poor prognosis with long-term survival in less than 30% of patients. When the disease is detected in stage I, more than 90% of patients can be cured by conventional therapy. Screening for early-stage disease with individual serum tumor markers, such as CA125, is limited by the fact that no single marker is up-regulated and shed in adequate amounts by all ovarian cancers. Consequently, use of multiple markers in combination might detect a larger fraction of early-stage ovarian cancers. Experimental Design: To identify potential candidates for novel markers, we have used Affymetrix human genome arrays (U95 series) to analyze differences in gene expression of 41,441 known genes and expressed sequence tags between five pools of normal ovarian surface epithelial cells (OSE) and 42 epithelial ovarian cancers of different stages, grades, and histotypes. Recursive descent partition analysis (RDPA) was performed with 102 probe sets representing 86 genes that were up-regulated at least 3-fold in epithelial ovarian cancers when compared with normal OSE. In addition, a panel of 11 genes known to encode potential tumor markers [mucin 1, transmembrane (MUC1), mucin 16 (CA125), mesothelin, WAP four-disulfide core domain 2 (HE4), kallikrein 6, kallikrein 10, matrix metalloproteinase 2, prostasin, osteopontin, tetranectin, and inhibin] were similarly analyzed. Results: The 3-fold up-regulated genes were examined and four genes [Notch homologue 3 (NOTCH3), E2F transcription factor 3 (E2F3), GTPase activating protein (RACGAP1), and hematological and neurological expressed 1 (HN1)] distinguished all tumor samples from normal OSE. The 3-fold up-regulated genes were analyzed using RDPA, and the combination of elevated claudin 3 (CLDN3) and elevated vascular endothelial growth factor (VEGF) distinguished the cancers from normal OSE. The 11 known markers were analyzed using RDPA, and a combination of HE4, CA125, and MUC1 expression could distinguish tumor from normal specimens. Expression at the mRNA level in the candidate markers was examined via semiquantitative reverse transcription-PCR and was found to correlate well with the array data. Immunohistochemistry was performed to identify expression of the genes at the protein level in 158 ovarian cancers of different histotypes. A combination of CLDN3, CA125, and MUC1 stained 157 (99.4%) of 158 cancers, and all of the tumors were detected with a combination of CLDN3, CA125, MUC1, and VEGF. Conclusions: Our data are consistent with the possibility that a limited number of markers in combination might identify >99% of epithelial ovarian cancers despite the heterogeneity of the disease.

Abstract Triple-negative breast cancers (TNBCs) tend to become highly invasive early during cancer development. Despite some successes in the initial treatment of patients diagnosed with early-stage localized TNBC, the rate of metastatic recurrence remains high with poor long-term survival outcomes. Here we show that elevated expression of the serine/threonine-kinase, Calcium/Calmodulin (CaM)-dependent protein kinase kinase-2 (CaMKK2), is highly correlated with tumor invasiveness. We determined that genetic disruption of CaMKK2 expression, or inhibition of its activity, disrupted spontaneous metastatic outgrowth from primary tumors in murine xenograft models of TNBC. High-grade serous ovarian cancer (HGSOC), a high-risk, poor-prognosis ovarian cancer subtype, shares many genetic features with TNBC, and importantly, CaMKK2 inhibition effectively blocked metastatic progression in a validated xenograft model of this disease. Probing the mechanistic links between CaMKK2 and metastasis we defined the elements of a new signaling pathway that impacts actin cytoskeletal dynamics in a manner which increases cell migration/invasion and metastasis. Notably, CaMKK2 increases the expression of the phosphodiesterase PDE1A which decreases the cGMP-dependent activity of protein kinase G1 (PKG1). This inhibition of PKG1 results in decreased phosphorylation of Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (VASP), which in its hypophosphorylated state binds to and regulates F-actin assembly to facilitate contraction/cell movement. Together, these data establish a targetable CaMKK2-PDE1A-PKG1-VASP signaling pathway that controls cancer cell motility and metastasis. Further, it credentials CaMKK2 as a therapeutic target that can be exploited in the discovery of agents for use in the neoadjuvant/adjuvant setting to restrict tumor invasiveness in patients diagnosed with early-stage TNBC or localized HGSOC.

Summary Growth factors in the tumor environment are key regulators of cell survival and metastasis. Here we reveal, dichotomy between TGF-β superfamily growth factors BMP and TGF-β/activin, and their downstream SMAD effectors. Gene expression profiling uncovered Sox2 as a key signaling node regulated in an opposing manner by anoikis-promoting BMP2, 4 and 9, and anoikis-suppressing TGF-β and activin A. We find that Sox2 repression by BMPs robustly inhibits intraperitoneal tumor burden and increases survival in multiple ovarian cancer models. Repression of Sox2 is driven by SMAD1 dependent histone H3K27me3 recruitment and DNA methylation at SOX2’s promoter. Conversely, TGF-β and activin A promote Sox2 expression, and anoikis resistance by SMAD3 mediated histone H3K4me3 recruitment. We find that balancing Sox2 levels is critical for anoikis, as transcriptomics reveals regulation of key cell death pathways. Moreover, BMP-driven SMAD1 signaling can override TGF-β and activin’s effect on Sox2, which has clinical significance due to the high levels of TGF-β we find in ovarian cancer patients. Together, our findings identify Sox2 as a contextual and contrastingly regulated key node, downstream of TGF-β superfamily members controlling anoikis and metastasis in ovarian cancers. Highlights Sox2 is a key node for anoikis resistance in cancer Sox2 is differentially regulated by TGF-β/activin and BMPs in broad cancers BMP9 is a robust metastasis suppressor by lowering Sox2 Sox2 regulation is contextual, epigenetic and at the transcriptional level

Objective: Ovarian cancer cells often exist in vivo as multicellular spheroids. Spheroid formation in vitro has been used to enrich for cancer stem cell populations from primary tumors. Such spheroids exhibit drug resistance and slow proliferation, suggesting involvement in disease recurrence. Our objectives were to characterize cancer spheroid phenotypes, determine gene expression profiles associated with spheroid forming capacity and to evaluate the responsiveness of spheroids to commonly used and novel therapeutic agents. Methods: Tumorigenic potential was assessed using anchorage independent growth assays in 24 cell lines. Spheroids from cell lines (N=12) and from primary cancers (N=8) were grown on non-adherent tissue culture plates in serum-free media. Cell proliferation was measured using MTT assays and Ki67 immunostaining. Affymetrix HT U133A gene expression data was used to identify differentially expressed genes based on spheroid forming capacity. Matched monolayers and spheroids (N=7 pairs) were tested for response to cisplatin, paclitaxel and 7-hydroxystaurosporine (UCN-01) while mitochondrial inhibition was performed using oligomycin. Xenograft tumors from intraperitoneal injection of CAOV2-GFP/LUC ovarian cancer cells into nude mice were treated with carboplatin to reduce tumor burden followed by secondary treatment with carboplatin, UCN-01, or Oltipraz. Tumor formation and response was monitored using live imaging. Results: Of 12 cell lines with increased anchorage-independent growth, 8 also formed spheroids under serum-free spheroid culture conditions. Spheroids showed reduced proliferation (p<0.0001) and Ki67 immunostaining (8% versus 87%) relative to monolayer cells. Spheroid forming capacity was associated with increased mitochondrial pathway activity (p≤0.001). The mitochondrial inhibitors, UCN-01 and Oligomycin, demonstrated effectiveness against spheroids, while spheroids were refractory to cisplatin and paclitaxel. By live in vivo imaging, ovarian cancer xenograft tumors were reduced after primary treatment with carboplatin. Continued treatment with carboplatin was accompanied by an increase in tumor signal while there was little or no increase in tumor signal observed with subsequent treatment with UCN-01 or Oltipraz. Conclusions: Our findings suggest that the mitochondrial pathway in spheroids may be an important therapeutic target in preventing disease recurrence.

Single agent immune checkpoint inhibitors have been ineffective for patients with advanced stage and recurrent high grade serous ovarian cancer (HGSOC). Using pre-clinical models of HGSOC, we evaluated the anti-tumor and immune stimulatory effects of an oncolytic adenovirus, MEM-288. This conditionally replicative virus encodes a modified membrane stable CD40L and IFNβ. We demonstrated this virus successfully infects HGSOC cell lines and primary human ascites samples in vitro. We evaluated the anti-tumor and immunostimulatory activity in vivo in immune competent mouse models. Intraperitoneal delivery of MEM-288 decreased ascites and solid tumor burden compared to controls, and treatment generated a systemic anti-tumor immune response. The tumor microenvironment had a higher proportion of anti-tumor macrophages and decreased markers of angiogenesis. MEM-288 is a promising immunotherapy agent in HGSOC, with further pre-clinical studies required to understand the mechanism of action in the peritoneal microenvironment and clinical activity in combination with other therapies.

Abstract In pathologies such as cancer, aberrant Transforming Growth Factor-β (TGF-β) signaling exerts profound tumor intrinsic and extrinsic consequences. Intense clinical endeavors are underway to target this pivotal pathway. Central to the success of these interventions is pinpointing factors that decisively modulate the TGF-β responses. Betaglycan/type III TGF-β receptor (TβRIII), is an established co-receptor for the TGF-β superfamily known to bind directly to TGF-βs 1-3 and inhibin A/B. While betaglycan can be membrane-bound, it can also undergo ectodomain cleavage to produce soluble-betaglycan that can sequester its ligands. The extracellular domain of betaglycan undergoes heparan sulfate and chondroitin sulfate glycosaminoglycan modifications, transforming betaglycan into a proteoglycan. Here we report the unexpected discovery that the heparan sulfate modifications are critical for the ectodomain shedding of betaglycan. In the absence of such modifications, betaglycan is not shed. Such shedding is indispensable for the ability of betaglycan to suppress TGF-β signaling and the cells’ responses to exogenous TGF-β ligands. Using unbiased transcriptomics, we identified TIMP3 as a key regulator of betaglycan shedding and thereby TGF-β signaling. Our results bear significant clinical relevance as modified betaglycan is present in the ascites of patients with ovarian cancer and can serve as a marker for predicting patient outcomes and TGF-β signaling responses. These studies are the first to demonstrate a unique reliance on the glycosaminoglycan modifications of betaglycan for shedding and influence on TGF-β signaling responses. Dysregulated shedding of TGF-β receptors plays a vital role in determining the response and availability of TGF-βs’, which is crucial for prognostic predictions and understanding of TGF-β signaling dynamics.