Abstract Compared to most ATP-site kinase inhibitors, small molecules that target an allosteric pocket have the potential for improved selectivity due to the often observed lower structural similarity at these distal sites. Despite their promise, relatively few examples of structurally confirmed, high-affinity allosteric kinase inhibitors exist. Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) is a target for many therapeutic indications, including non-hormonal contraception. 1 However, an inhibitor against this kinase with exquisite selectivity has not reached the market because of the structural similarity between CDKs. 1-2 In this paper, we describe the development and mechanism of action of new type III inhibitors that bind CDK2 with nanomolar affinity, making them the highest affinity, structurally confirmed allosteric CDK inhibitors reported. Notably, these anthranilic acid inhibitors exhibit a strong negative cooperative relationship with cyclin binding, which remains an underexplored mechanism for CDK2 inhibition. Furthermore, the binding profile of these compounds in both biophysical and cellular assays demonstrate the promise of this series for further development into a therapeutic selective for CDK2 over highly similar kinases like CDK1. The potential of these inhibitors as efficacious contraceptive agents is seen by incubation with mouse testicular explants, where they recapitulate Cdk2 -/- and Spdya -/- phenotypes.

Summary Paragraph MYCN amplification is the most frequent genetic driver in high-risk neuroblastoma (NB) and strongly associated with poor prognosis. 1,2 The N-Myc transcription factor, which is encoded by MYCN , is a mechanistically validated, yet challenging target for NB therapy development. 3,4 In normal neuronal progenitors, N-Myc undergoes rapid degradation, while in MYCN -amplified NB cells, Aurora kinase A (Aurora-A) binds to and stabilizes N-Myc, resulting in elevated protein levels. 5,6 Allosteric Aurora-A inhibitors that displace N-Myc from binding can promote N-Myc degradation, but with limited efficacy. 7–10 Here, we report a chemical approach to decrease N-Myc levels through the targeted protein degradation of Aurora-A. A first-in-class Aurora-A/N-Myc degrader, HLB-0532259 (compound 4 ), was developed from a novel Aurora-A-binding ligand that engages the Aurora-A/N-Myc complex. HLB-0532259 promotes the degradation of both Aurora-A and N-Myc with nanomolar potency and excellent selectivity and surpasses the cellular efficacy of established allosteric Aurora-A inhibitors. HLB-0532259 exhibits favorable pharmacokinetics properties and elicits tumor reduction in murine xenograft NB models. More broadly, this study delineates a novel strategy for targeting “undruggable” proteins that are reliant on accessory proteins for cellular stabilization.

Both first-generation αC-out and newer αC-in RAF inhibitors paradoxically activate BRAF kinase at subsaturating concentrations. Paradoxical activation by αC-in inhibitors is linked to the formation of BRAF dimers, but why activation rather than inhibition occurs remains unclear. We used biophysical methods tracking BRAF conformation and dimerization combined with thermodynamic modeling to define the allosteric coupling mechanism underlying paradoxical activation. Allosteric coupling between αC-in inhibitors and BRAF dimerization is both extremely strong and highly asymmetric, with the first inhibitor contributing the bulk of dimer promotion. This asymmetric allosteric coupling mechanism results in the induction of dimers in which only one protomer is inhibited while the other is activated. The type II class of RAF inhibitors currently in clinical trials are more asymmetrically coupled and possess greater activation potential than older type I inhibitors. 19 F NMR data demonstrate that the BRAF dimer displays dynamic conformational asymmetry, with only a subset of protomers locked in the αC-in state, explaining how the conformational effects of drug binding can efficiently drive BRAF dimerization and activation at substoichiometric concentrations.

Abstract Kinases play a critical role in many cellular signaling pathways and are dysregulated in a number of diseases, such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. Since the FDA approval of imatinib in 2001, therapeutics targeting kinases now account for roughly 50% of current cancer drug discovery efforts. The ability to explore human kinase biochemistry, biophysics, and structural biology in the laboratory is essential to making rapid progress in understanding kinase regulation, designing selective inhibitors, and studying the emergence of drug resistance. While insect and mammalian expression systems are frequently used for the expression of human kinases, bacterial expression systems are superior in terms of simplicity and cost-effectiveness but have historically struggled with human kinase expression. Following the discovery that phosphatase coexpression could produce high yields of Src and Abl kinase domains in bacterial expression systems, we have generated a library of 52 His-tagged human kinase domain constructs that express above 2 µ g/mL culture in a simple automated bacterial expression system utilizing phosphatase coexpression (YopH for Tyr kinases, Lambda for Ser/Thr kinases). Here, we report a structural bioinformatics approach to identify kinase domain constructs previously expressed in bacteria likely to express well in a simple high-throughput protocol, experiments demonstrating our simple construct selection strategy selects constructs with good expression yields in a test of 84 potential kinase domain boundaries for Abl, and yields from a high-throughput expression screen of 96 human kinase constructs. Using a fluorescence-based thermostability assay and a fluorescent ATP-competitive inhibitor, we show that the highest-expressing kinases are folded and have well-formed ATP binding sites. We also demonstrate how the resulting expressing constructs can be used for the biophysical and biochemical study of clinical mutations by engineering a panel of 48 Src mutations and 46 Abl mutations via single-primer mutagenesis and screening the resulting library for expression yields. The wild-type kinase construct library is available publicly via Addgene, and should prove to be of high utility for experiments focused on drug discovery and the emergence of drug resistance.

Many eukaryotic protein kinases are activated by phosphorylation on a specific conserved residue in the regulatory activation loop, a post-translational modification thought to stabilize the active DFG-In state of the catalytic domain. Here we use a battery of spectroscopic methods that track different catalytic elements of the kinase domain to show that the ~100-fold activation of the mitotic kinase Aurora A (AurA) by phosphorylation occurs without a population shift to the DFG-In state, and that the activation loop of the activated kinase remains highly dynamic. Instead, molecular dynamics simulations and electron paramagnetic resonance experiments show that phosphorylation profoundly alters the structure and dynamics of the DFG-In subpopulation, leading to activation of the kinase. Kinetics experiments tracking structural transitions during nucleotide binding suggest that a substantial DFG-Out subpopulation is an important feature of activated AurA that evolved to optimize the kinetics of substrate binding and product release.