ABSTRACT Large enzyme families catalyze metabolic diversification by virtue of their ability to use diverse chemical scaffolds. How enzyme families attain such functional diversity is not clear. Here, we addressed this question using BAHD acyltransferases as a model, and identified the routes by which duplication, promiscuity and sequence changes influenced BAHD diversification. This fast-evolving family expanded drastically during land plant evolution from 1-5 copies in algae to ∼100 copies in diploid angiosperm genomes. In vitro characterization of fourteen BAHDs against a substrate panel and compilation of >160 published activities revealed the wide prevalence of promiscuity among BAHDs. Using phylogenetic analysis, we predicted the substrate classes that the ancestral enzymes were likely capable of using prior to land plant origins. While the anthocyanin acylation activity was fixed in BAHDs later near the origin of angiosperms, in vitro testing of BAHDs from non-seed plant lineages suggested that the ability to acylate anthocyanins likely existed promiscuously millions of years prior to its fixation. Motif enrichment analysis in anthocyanin-acylating BAHDs identified two motifs fixed in the largest anthocyanin acylating clade. Molecular dynamic simulations and enzyme kinetics revealed the important role of an active site tryptophan, whose bulkiness, hydrophobicity and aromaticity are critical for anthocyanin acylation. Our results thus describe the molecular processes in robust, evolvable enzymes that drive emergence of functional diversity in enzyme families. One sentence summary Using a combination of phylogenetics, biochemistry and protein structure analysis, we investigated how the BAHD acyltransferase family evolved to use a structurally diverse array of substrates.

Abstract Identifying along which lineages shifts in diversification rates occur is a central goal of comparative phylogenetics; these shifts may coincide with key evolutionary events such as the development of novel morphological characters, the acquisition of adaptive traits, polyploidization or other structural genomic changes, or dispersal to a new habitat and subsequent increase in environmental niche space. However, while multiple methods now exist to estimate diversification rates and identify shifts using phylogenetic topologies, the appropriate use and accuracy of these methods is hotly debated. Here we test whether five Bayesian methods—Bayesian Analysis of Macroevolutionary Mixtures ( BAMM ), two implementations of the Lineage-Specific Birth-Death-Shift model ( LSBDS and PESTO ), the approximate Multi-Type Birth-Death model ( MTBD ; implemented in BEAST2 ), and the cladogenetic diversification rate shift model ( CLaDS2 )—produce comparable results. We apply each of these methods to a set of 65 empirical time-calibrated phylogenies and compare inferences of speciation rate, extinction rate, and net diversification rate. We find that the five methods often infer different speciation, extinction, and net-diversification rates. Consequently, these different estimates may lead to different interpretations of the macroevolutionary dynamics. The different estimates can be attributed to fundamental differences among the compared models. Therefore, the inference of shifts in diver-sification rates is strongly method-dependent. We advise biologists to apply multiple methods to test the robustness of the conclusions or to carefully select the method based on the validity of the underlying model assumptions to their particular empirical system. Lay Summary Understanding why some groups of organisms have more species than others is key to understanding the origin of biodiversity. Theory and empirical evidence suggest that multiple distinct historical events—such as the evolution of particular morphological features (e.g., the flower, the tetrapod limb) and competition amongst species—can produce this pattern of divergent species richness. Identifying when and where on the tree of life shifts in diversification rates occur is important for explaining the origin of modern-day biodiversity and understanding how disparity among species evolves. Several statistical methods have been developed to infer diversification rates and identify these shifts. While these methods each attempt to make inferences about changes in the tempo of diversification, they differ in their underlying statistical models and assumptions. Here we test if these methods draw similar conclusions using a dataset of 65 time-calibrated phylogenies from across multicellular life. We find that inferences of where rate shifts occur strongly depends on the chosen method. Therefore, biologists should choose the model whose assumptions they believe to be the most valid and justify their model choice a priori , or consider using several independent methods to test an evolutionary hypothesis.

Many species from across the vascular plant tree-of-life have modified standard plant tissues into tubers, bulbs, corms, and other underground storage organs (USOs). Bomarea multiflora (Alstroemeriaceae) is a tropical climbing monocot with unique underground morphology, including tuberous roots. We take a comparative transcriptomics approach to characterizing the molecular mechanisms of tuberous root formation in B. multiflora and compare these mechanisms to those identified in other underground storage structures across diverse plant lineages. We sequenced transcriptomes from the growing tip of four tissue types (aerial shoot, rhizome, fibrous root, and root tuber) of three individuals of B. multiflora. We identify differentially expressed isoforms and test the expression of candidate genes that have been implicated in underground storage in other taxa. We identify 271 genes that are differentially expressed in root tubers versus fibrous roots, including genes implicated in cell wall modification, environmental signaling and flowering time, and starch biosynthesis. We also identify a phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP) that is over-expressed in tuberous roots. These findings demonstrate that deeply parallel processes underlie the formation of underground storage structures despite long evolutionary distances between taxa and non-homologous morphologies, illustrating that repeated co-option of similar genetic pathways can lead to convergent morphologies.