Abstract Type III Secretion Systems (T3SS) deliver subunits from the bacterial cytosol to nascent cell surface flagella. Early flagellar subunits that form the rod and hook substructures are unchaperoned and contain their own export signals. A gate recognition motif (GRM) docks them at the FlhBc component of the FlhAB-FliPQR export gate, but the gate must then be opened and subunits must be unfolded to pass through the flagellar channel. This induced us to seek further signals on the subunits. Here, we identify a second signal at the extreme N-terminus of flagellar rod and hook subunits and determine that key to the signal is its hydrophobicity. We show that the two export signal elements are recognised separately and sequentially, as the N-terminal signal is recognised by the flagellar export machinery only after subunits have docked at FlhB C via the GRM. The position of the N-terminal hydrophobic signal in the subunit sequence relative to the GRM appeared to be important, as a FlgD deletion variant (FlgD short ), in which the distance between the N-terminal signal and the GRM was shortened, ‘stalled’ at the export machinery and was not exported. The attenuation of motility caused by FlgD short was suppressed by mutations that destabilised the closed conformation of the FlhAB-FliPQR export gate, suggesting that the hydrophobic N-terminal signal might trigger opening of the flagellar export gate.

Abstract Translational control in pathogenic bacteria is fundamental to gene expression and affects virulence and other infection phenotypes. We used an enhanced ribosome profiling protocol coupled with parallel transcriptomics to capture accurately the global translatome of two evolutionarily distant pathogenic bacteria – the Gram-negative bacterium Salmonella and the Gram positive bacterium Listeria We find that the two bacteria use different mechanisms to translationally regulate protein synthesis. In Salmonella, in addition to the expected correlation between translational efficiency and cis -regulatory features such as Shine-Dalgarno (SD) strength and RNA secondary structure around the initiation codon, our data reveal an effect of the 2 nd and 3 rd codons, where the presence of tandem lysine codons (AAA-AAA) enhances translation in both Salmonella and E. coli . Strikingly, none of these features are seen in efficiently translated Listeria transcripts. Instead, approximately 15% of efficiently translated Listeria genes exhibit 70S footprints seven nt upstream of the authentic start codon, suggesting that these genes may be subject to a novel translational initiation mechanism. Our results show that SD strength is not a direct hallmark of translational efficiency in all bacteria. Instead, Listeria has evolved additional mechanisms to control gene expression level that are distinct from those utilised by Salmonella and E. coli . ‘For the purpose of open access, the author has applied a Creative Commons Attribution (CC BY) licence to any Author Accepted Manuscript version arising ’

Abstract Salmonella is a globally important pathogen that actively invades and replicates within host cells, including epithelial cells and macrophages, during infection. Bacterial internalization is predominantly orchestrated by the Salmonella SPI-1 Type III secretion system (T3SS). The SPI-1 T3SS transports effectors directly through the host cell membrane and into its cytosol to trigger Salmonella uptake. Here, we demonstrate that Salmonella rapidly synthesizes SPI-1 components as they encounter potential host macrophages, priming the bacteria for host invasion. Assembly of the T3SS in the host membrane results in transient pore formation. We show that this leads to the surge of translational induction of host transcription factors, including Egr1 . In macrophages, the rapid synthesis of EGR1 results in the suppression of immune response and pro-apoptotic genes. Thus, SPI-1-mediated membrane damage limits the macrophage immune response to Salmonella infection

Coenzyme A (CoA) is a fundamental co-factor for all life, involved in numerous metabolic pathways and cellular processes, and its biosynthetic pathway has raised substantial interest as a drug target against multiple pathogens including Mycobacterium tuberculosis . The biosynthesis of CoA is performed in five steps, with the second and third steps being catalysed in the vast majority of prokaryotes, including M. tuberculosis , by a single bifunctional protein, CoaBC. Depletion of CoaBC was found to be bactericidal in M. tuberculosis . Here we report the first structure of a full-length CoaBC, from the model organism Mycobacterium smegmatis , describe how it is organised as a dodecamer and regulated by CoA thioesters. A high-throughput biochemical screen focusing on CoaB identified two inhibitors with different chemical scaffolds. Hit expansion led to the discovery of potent inhibitors of M. tuberculosis CoaB, which we show to bind to a novel cryptic allosteric site within CoaB.

Bacterial flagellar subunits are exported across the cell membrane by the flagellar Type III Secretion System (fT3SS), powered by the proton motive force (pmf) and a specialized ATPase that enables the flagellar export gate to utilise the pmf electric potential (ΔΨ). Export gate activation is mediated by the ATPase stalk, FliJ, but how this process is regulated to prevent wasteful dissipation of pmf in the absence of subunit cargo is not known. Here, we show that FliJ activation of the export gate is regulated by flagellar export chaperones. FliJ binds unladen chaperones and, using novel chaperone variants specifically defective for FliJ binding, we show that disruption of this interaction attenuates motility and cognate subunit export. We demonstrate in vitro that chaperones and the FlhA export gate component compete for binding to FliJ, and show in vivo that unladen chaperones, which would be present in the cell when subunit levels are low, sequester FliJ to prevent activation of the export gate and attenuate subunit export. Our data indicate a mechanism whereby chaperones couple availability of subunit cargo to pmf-driven export by the fT3SS.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Type III Secretion Systems (T3SS) transport proteins from the bacterial cytosol for assembly into cell surface nanomachines or for direct delivery into target eukaryotic cells. At the core of the flagellar T3SS, the FlhAB-FliPQR export gate regulates protein entry into the export channel whilst maintaining the integrity of the cell membrane. Here, we identify critical residues in the export gate FliR plug that stabilise the closed conformation, preserving the membrane permeability barrier, and we show that the gate opens and closes in response to export substrate availability. Our data indicate that FlhAB-FliPQR gate opening, which is triggered by substrate export signals, is energised by FlhA in a proton motive force-dependent manner. We present evidence that the export substrate and the FliJ stalk of the flagellar ATPase provide mechanistically distinct, non-redundant gate-activating signals that are critical for efficient export.