Abstract The regulated excretion of CO 2 during breathing is a key life-preserving homeostatic mechanism. In the rostral medulla oblongata, neurons in two nuclei -the retrotrapezoid nucleus (RTN) and the rostral medullary Raphe -have been proposed as central CO 2 chemosensors that mediate adaptive changes in breathing. One such adaptive change is active expiration, thought to be controlled by the lateral parafacial region (pF L ). Here we use promoter-driven expression of GCaMP6 and head-mounted mini-microscopes to image the Ca 2+ activity in neurons and glia of RTN, Raphe and pF L in awake adult mice during inspiration of elevated CO 2 to discriminate their roles in the adaptive response to hypercapnia. While there were multiple types of neuronal response to hypercapnia in both the RTN and the Raphe, a substantial proportion of neurons in the Raphe encoded the inspired level of CO 2 . By contrast, such responses were very rare in the RTN and the responses of RTN neurons suggest that this nucleus plays an integrative rather than a direct sensing role in the chemosensory reflex. pF L neurons were reliably activated by hypercapnia and their activity preceded active expiration suggesting a key causal link to this aspect of breathing. Our analysis considerably revises understanding of chemosensory control in the adult awake mouse and paves the way to understanding how breathing is coordinated with complex non-ventilatory behaviours such as swallowing and vocalisation.

Abstract Genetic variants in α-actinin-2 (ACTN2) are associated with several forms of (cardio)myopathy. We previously reported a heterozygous missense (c.740C>T) ACTN2 gene variant, associated with hypertrophic cardiomyopathy, and characterized by an electro-mechanical phenotype in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). Here, we created with CRISPR/Cas9 genetic tools two heterozygous functional knock-out hiPSC lines with a second wild-type (ACTN2wt) and missense ACTN2 (ACTN2mut) allele, respectively. We evaluated their impact on cardiomyocyte structure and function, using a combination of different technologies, including immunofluorescence and live cell imaging, RNA-seq, and mass spectrometry. This study showed that ACTN2mut present a higher percentage of multinucleation, protein aggregation, hypertrophy, myofibrillar disarray and activation of both the ubiquitin-proteasome system and the autophagy-lysosomal pathway as compared to ACTN2wt in 2D-cultured hiPSC-CMs. Furthermore, the expression of ACTN2mut was associated with a marked reduction of sarcomere-associated protein levels in 2D-cultured hiPSC-CMs and force impairment in engineered heart tissues. In conclusion, our study highlights the activation of proteolytic systems in ACTN2mut hiPSC-CMs likely to cope with ACTN2 aggregation and therefore directs towards proteopathy as an additional cellular pathology caused by this ACTN2 variant, which may contribute to human ACTN2 -associated cardiomyopathies.

Abstract Rationale Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common cardiac genetic disorder caused by sarcomeric gene variants and associated with left ventricular (LV) hypertrophy and diastolic dysfunction. The role of the microtubule network has recently gained interest with the findings that α-tubulin detyrosination (dTyr-tub) is markedly elevated in heart failure. Reduction of dTyr-tub by inhibition of the detyrosinase (VASH/SVBP complex) or activation of the tyrosinase (tubulin tyrosine ligase, TTL) markedly improved contractility and reduced stiffness in human failing cardiomyocytes, and thus poses a new perspective for HCM treatment. Objective In this study, we tested the impact of targeting dTyr-tub in a mouse model of HCM, the Mybpc3 -targeted knock-in (KI) mice, and in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiomyocytes and engineered heart tissues (EHTs) deficient in SVBP or TTL. Methods and Results TTL gene transfer was tested in wild-type (WT) mice and rats and in adult KI mice. We show that i) TTL dose-dependently reduced dTyr-tub and improved contractility without affecting cytosolic calcium transients in WT cardiomyocytes; ii) TTL partially improved LV function and diastolic filling, reduced stiffness and normalized cardiac output and stroke volume in KI mice; iii) TTL induced a marked transcription and translation of several tubulins in KI mice; iv) TTL modulated mRNA or protein levels of components of mitochondria, Z-disc, ribosome, intercalated disc, lysosome and cytoskeleton in KI mice; v) SVBP-KO and TTL-KO EHTs exhibited low and high dTyr-tub levels, higher and lower force of contraction and enhanced and prolonged relaxation than in WT EHTs, respectively. RNA-seq and mass spectrometry analysis revealed distinct enrichment of cardiomyocyte components and pathways in SVBP-KO vs. TTL-KO EHTs. Conclusion This study provides evidence that reducing dTyr-tub improves function in HCM mouse hearts and human EHTs and holds promise for targeting the non-sarcomeric cytoskeleton in heart disease.

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are powerful tools for the sustained expression of proteins in vivo and have been successfully used for mechanistic studies in mice. A major challenge associated with this method is to obtain tissue specificity and high expression levels without need of local virus administration.