A major cause of the paucity of new starting points for drug discovery is the lack of interaction between academia and industry. Much of the global resource in biology is present in universities, whereas the focus of medicinal chemistry is still largely within industry. Open source drug discovery, with sharing of information, is clearly a first step towards overcoming this gap. But the interface could especially be bridged through a scale-up of open sharing of physical compounds, which would accelerate the finding of new starting points for drug discovery. The Medicines for Malaria Venture Malaria Box is a collection of over 400 compounds representing families of structures identified in phenotypic screens of pharmaceutical and academic libraries against the Plasmodium falciparum malaria parasite. The set has now been distributed to almost 200 research groups globally in the last two years, with the only stipulation that information from the screens is deposited in the public domain. This paper reports for the first time on 236 screens that have been carried out against the Malaria Box and compares these results with 55 assays that were previously published, in a format that allows a meta-analysis of the combined dataset. The combined biochemical and cellular assays presented here suggest mechanisms of action for 135 (34%) of the compounds active in killing multiple life-cycle stages of the malaria parasite, including asexual blood, liver, gametocyte, gametes and insect ookinete stages. In addition, many compounds demonstrated activity against other pathogens, showing hits in assays with 16 protozoa, 7 helminths, 9 bacterial and mycobacterial species, the dengue fever mosquito vector, and the NCI60 human cancer cell line panel of 60 human tumor cell lines. Toxicological, pharmacokinetic and metabolic properties were collected on all the compounds, assisting in the selection of the most promising candidates for murine proof-of-concept experiments and medicinal chemistry programs. The data for all of these assays are presented and analyzed to show how outstanding leads for many indications can be selected. These results reveal the immense potential for translating the dispersed expertise in biological assays involving human pathogens into drug discovery starting points, by providing open access to new families of molecules, and emphasize how a small additional investment made to help acquire and distribute compounds, and sharing the data, can catalyze drug discovery for dozens of different indications. Another lesson is that when multiple screens from different groups are run on the same library, results can be integrated quickly to select the most valuable starting points for subsequent medicinal chemistry efforts.

Abstract Many mosquito species, including the major malaria vector Anopheles gambiae , naturally undergo multiple reproductive cycles of blood feeding, egg development and egg laying in their lifespan. Such complex mosquito behavior is regularly overlooked when mosquitoes are experimentally infected with malaria parasites, limiting our ability to accurately describe potential effects on transmission. Here, we examine how Plasmodium falciparum development and transmission potential is impacted when infected mosquitoes feed an additional time. We measured P. falciparum oocyst size and performed sporozoite time course analyses to determine the parasite’s extrinsic incubation period (EIP), i.e. the time required by parasites to reach infectious sporozoite stages, in An. gambiae females blood fed either once or twice. An additional blood feed at 3 days post infection drastically accelerates oocyst growth rates, causing earlier sporozoite accumulation in the salivary glands, thereby shortening the EIP (reduction of 2.25 ± 0.39 days). Moreover, parasite growth is further accelerated in transgenic mosquitoes with reduced reproductive capacity, which mimic genetic modifications currently proposed in population suppression gene drives. We incorporate our shortened EIP values into a measure of transmission potential, the basic reproduction number R 0 , and find the average R 0 is remarkably higher (range: 10.1%–12.1% increase) across sub-Saharan Africa than when using traditional EIP measurements. These data suggest that malaria elimination may be substantially more challenging and that younger mosquitoes or those with reduced reproductive ability may provide a larger contribution to infection than currently believed. Our findings have profound implications for current and future mosquito control interventions. Significance Statement In natural settings the female Anopheles gambiae mosquito, the major malaria vector, blood feeds multiple times in her lifespan. Here we demonstrate that an additional blood feed accelerates the growth of Plasmodium falciparum malaria parasites in this mosquito. Incorporating these data into a mathematical model across sub-Saharan Africa reveals that malaria transmission potential is likely to be substantially higher than previously thought, making disease elimination more difficult. Additionally, we show that control strategies that manipulate mosquito reproduction with the aim of suppressing Anopheles populations may inadvertently favor malaria transmission. Our data also suggest that parasites can be transmitted by younger mosquitoes, which are less susceptible to insecticide killing, with negative implications for the success of insecticide-based strategies.

Abstract Wolbachia infections are a fascinating example of reproductive parasitism with strong potential to combat vector-borne diseases, due to their combined ability to spread in insect populations and block pathogen replication. Though the Wolbachia factors mediating the notable reproductive manipulation cytoplasmic incompatibility (CI) have now been identified as prophage WO genes cifA and cifB , the relative role of these genes is still intensely debated, with different models claiming that CI requires either both factors or cifB alone. Here we investigated whether cifA and cifB are sufficient to induce conditional sterility in the major malaria vector Anopheles gambiae , a species that appears to have limited susceptibility to invasion by Wolbachia . We report that CI can be fully recapitulated in these mosquitoes, and that cifB is sufficient to cause this reproductive manipulation. cifB -induced sterility is fully rescued by high levels of cifA expression in females. Surprisingly, however, when cifA is highly expressed in males alongside cifB , the CI phenotype is attenuated. cifB strongly impairs fertility also when expressed in the female germline, again mitigated by cifA . These data support a system whereby cifB and cifA must be fine-tuned to exercise CI and rescue, respectively, possibly explaining the limited success of Wolbachia at invading Anopheles . Our findings pave the way towards facilitating Wolbachia infections in anopheline vectors, for use in malaria control strategies.

Females from many mosquito species feed on blood to acquire nutrients for egg development. The oogenetic cycle has been characterized in the arboviral vector Aedes aegypti, where after a bloodmeal, the lipid transporter lipophorin (Lp) shuttles lipids from the midgut and fat body to the ovaries, and a yolk precursor protein, vitellogenin (Vg), is deposited into the oocyte by receptor-mediated endocytosis. Our understanding of how the roles of these two nutrient transporters are mutually coordinated is however limited in this and other mosquito species. Here, we demonstrate that in the malaria mosquito Anopheles gambiae, Lp and Vg are reciprocally regulated in a timely manner to optimize egg development and ensure fertility. Defective lipid transport via Lp silencing triggers abortive ovarian follicle development, leading to misregulation of Vg and aberrant yolk granules. Conversely, depletion of Vg causes an upregulation of Lp in the fat body in a manner that appears to be at least partially dependent on target of rapamycin (TOR) signaling, resulting in excess lipid accumulation in the developing follicles. Embryos deposited by Vg-depleted mothers are completely infertile, and are arrested early during development, likely due to severely reduced amino acid levels and protein synthesis. Our findings demonstrate that the mutual regulation of these two nutrient transporters is essential to safeguard fertility by ensuring correct nutrient balance in the developing oocyte, and validate Vg and Lp as two potential candidates for mosquito control.

Abstract Anopheles coluzzii females, important malaria vectors in Africa, mate only once in their lifetime. Mating occurs in aerial swarms with a high male-to-female ratio, where the traits underlying male mating success are largely unknown. Here, we investigated whether cuticular hydrocarbons (CHCs) influence mating success in natural mating swarms in Burkina Faso. As insecticides are widely used in this area for malaria control, we also determined whether CHCs affect insecticide resistance levels. We find that mated males have higher CHC abundance than unmated controls, suggesting CHCs could be a determinant of mating success. Additionally, mated males have higher insecticide resistance under pyrethroid challenge, and we show a link between resistance intensity and CHC abundance. Taken together, our results reveal overlapping roles played by CHCs in mate choice and insecticide resistance, and point to sexual selection for insecticide resistance traits that limit the efficacy of our best malaria control tools.