Fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS) results from a CGG repeat expansion in the 5′ UTR of FMR1. This repeat is thought to elicit toxicity as RNA, yet disease brains contain ubiquitin-positive neuronal inclusions, a pathologic hallmark of protein-mediated neurodegeneration. We explain this paradox by demonstrating that CGG repeats trigger repeat-associated non-AUG-initiated (RAN) translation of a cryptic polyglycine-containing protein, FMRpolyG. FMRpolyG accumulates in ubiquitin-positive inclusions in Drosophila, cell culture, mouse disease models, and FXTAS patient brains. CGG RAN translation occurs in at least two of three possible reading frames at repeat sizes ranging from normal (25) to pathogenic (90), but inclusion formation only occurs with expanded repeats. In Drosophila, CGG repeat toxicity is suppressed by eliminating RAN translation and enhanced by increased polyglycine protein production. These studies expand the growing list of nucleotide repeat disorders in which RAN translation occurs and provide evidence that RAN translation contributes to neurodegeneration.

A repeat expansion in C9ORF72 causes frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis (c9FTD/ALS). RNA of the expanded repeat (r(GGGGCC)exp) forms nuclear foci or undergoes repeat-associated non-ATG (RAN) translation, producing “c9RAN proteins.” Since neutralizing r(GGGGCC)exp could inhibit these potentially toxic events, we sought to identify small-molecule binders of r(GGGGCC)exp. Chemical and enzymatic probing of r(GGGGCC)8 indicate that it adopts a hairpin structure in equilibrium with a quadruplex structure. Using this model, bioactive small molecules targeting r(GGGGCC)exp were designed and found to significantly inhibit RAN translation and foci formation in cultured cells expressing r(GGGGCC)66 and neurons transdifferentiated from fibroblasts of repeat expansion carriers. Finally, we show that poly(GP) c9RAN proteins are specifically detected in c9ALS patient cerebrospinal fluid. Our findings highlight r(GGGGCC)exp-binding small molecules as a possible c9FTD/ALS therapeutic and suggest that c9RAN proteins could potentially serve as a pharmacodynamic biomarker to assess efficacy of therapies that target r(GGGGCC)exp.

Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) is an inherited neurodegenerative disorder caused by the expansion of 55-200 CGG repeats in the 5 0 UTR of FMR1.These expanded CGG repeats are transcribed and accumulate in nuclear RNA aggregates that sequester one or more RNA-binding proteins, thus impairing their functions.Here, we have identified that the double-stranded RNAbinding protein DGCR8 binds to expanded CGG repeats, resulting in the partial sequestration of DGCR8 and its partner, DROSHA, within CGG RNA aggregates.Consequently, the processing of micro-RNAs (miRNAs) is reduced, resulting in decreased levels of mature miRNAs in neuronal cells expressing expanded CGG repeats and in brain tissue from patients with FXTAS.Finally, overexpression of DGCR8 rescues the neuronal cell death induced by expression of expanded CGG repeats.These results support a model in which a human neurodegenerative disease originates from the alteration, in trans, of the miRNA-processing machinery.

Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) is a neurodegenerative disorder caused by a limited expansion of CGG repeats in the 5′ UTR of FMR1. Two mechanisms are proposed to cause FXTAS: RNA gain-of-function, where CGG RNA sequesters specific proteins, and translation of CGG repeats into a polyglycine-containing protein, FMRpolyG. Here we developed transgenic mice expressing CGG repeat RNA with or without FMRpolyG. Expression of FMRpolyG is pathogenic, while the sole expression of CGG RNA is not. FMRpolyG interacts with the nuclear lamina protein LAP2β and disorganizes the nuclear lamina architecture in neurons differentiated from FXTAS iPS cells. Finally, expression of LAP2β rescues neuronal death induced by FMRpolyG. Overall, these results suggest that translation of expanded CGG repeats into FMRpolyG alters nuclear lamina architecture and drives pathogenesis in FXTAS.

Abstract Repeat-associated non-AUG (RAN) translation allows for unconventional initiation at disease-causing repeat expansions. As RAN translation contributes to pathogenesis in multiple neurodegenerative disorders, determining its mechanistic underpinnings may inform therapeutic development. Here we analyze RAN translation at G 4 C 2 repeat expansions that cause C9orf72 -associated amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia (C9RAN) and at CGG repeats that cause fragile X-associated tremor/ataxia syndrome. We find that C9RAN translation initiates through a cap- and eIF4A-dependent mechanism that utilizes a CUG start codon. C9RAN and CGG RAN are both selectively enhanced by integrated stress response (ISR) activation. ISR-enhanced RAN translation requires an eIF2α phosphorylation-dependent alteration in start codon fidelity. In parallel, both CGG and G 4 C 2 repeats trigger phosphorylated-eIF2α-dependent stress granule formation and global translational suppression. These findings support a model whereby repeat expansions elicit cellular stress conditions that favor RAN translation of toxic proteins, creating a potential feed-forward loop that contributes to neurodegeneration.

ABSTRACT GGGGCC (G 4 C 2 ) hexanucleotide repeat expansions (HRE) in C9orf72 are the most common genetic cause of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). Repeat-associated non-AUG (RAN) translation of this expansion generates toxic proteins that accumulate in patient brains and contribute to disease pathogenesis. The DEAH-Box Helicase 36 (DHX36/G4R1) plays active roles in RNA and DNA G-quadruplex (G4) resolution in cells. As G 4 C 2 repeats form G4 structures in vitro , we sought to determine the impact of manipulating DHX36 expression on repeat transcription and RAN translation. We found that DHX36 depletion suppresses RAN translation from reporter constructs in a repeat length dependent manner while overexpression of DHX36 enhances RAN translation from G 4 C 2 reporter RNAs. Taken together, these results suggest that DHX36 is active in regulating G 4 C 2 repeat translation, providing potential implications for therapeutic development in nucleotide repeats expansion disorders.

Abstract Repeat associated non-AUG (RAN) translation of mRNAs containing repeat-expansion mutations produces toxic peptides in neurons of patients suffering from neurodegenerative diseases. Recent findings indicate that RAN translation in diverse model systems is not inhibited by cellular stressors that impair global translation through phosphorylation of the alpha subunit of eIF2, the essential eukaryotic translation initiation factor that brings the initiator tRNA to the 40S ribosome. Using in vitro , cell-based, and Drosophila models, we examined the role of alternative ternary complex factors that may function in place of eIF2, including eIF2A, eIF2D, and DENR/MCTS1. Among these factors, DENR knockdown had the greatest inhibitory effect on RAN translation of expanded GGGGCC and CGG repeat reporters, and its reduction improved survival of Drosophila expressing expanded GGGGCC repeats. Taken together, these data support a role for alternative initiation factors in RAN translation and suggest they may serve as novel therapeutic targets in neurodegenerative disease.

Abstract Repeat associated non-AUG (RAN) translation of FMR1 5’ UTR CGG repeats produces toxic homo-polymeric proteins that accumulate within ubiquitinated inclusions in Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) patient brains and model systems. The most abundant RAN product, FMRpolyG, initiates predominantly at an ACG codon located just 5’ to the repeat. Methods to accurately measure FMRpolyG in FXTAS patients are lacking. Here we used data dependent acquisition (DDA) and parallel reaction monitoring (PRM) mass spectrometry coupled with stable isotope labeled standard peptides (SIS) to identify potential signature FMRpolyG fragments in patient cells and tissues. Following immunoprecipitation (IP) enrichment, we detected FMRpolyG signature peptides by PRM in transfected cells, FXTAS human samples and patient derived stem cells, but not in controls. Surprisingly, we identified two amino-terminal peptides: one beginning with methionine (Ac-MEAPLPGGVR) initiating at an ACG, and a second beginning with threonine (Ac-TEAPLPGGVR), initiating at a GUG. Abundance of the threonine peptide was enhanced relative to the methionine peptide upon activation of the integrated stress response. In addition, loss of the eIF2 alternative factor, eIF2A, or enhanced expression of initiation factor eIF1, preferentially suppressed GUG initiated FMRpolyG synthesis. These data demonstrate that FMRpolyG is quantifiable in human samples and that RAN translation on FMR1 initiates at specific near cognate codons dependent on available initiation factors and cellular environment.

ABSTRACT RNAs derived from expanded nucleotide repeats form detectable foci in patient cells and these foci are thought to contribute to disease pathogenesis. The most widely used method for detecting RNA foci is fluorescence in situ hybridization (FISH). However, FISH is prone to low sensitivity and photo-bleaching that can complicate data interpretation. Here we applied hybridization chain reaction (HCR) as an alternative approach to repeat RNA foci detection of GC-rich repeats in two neurodegenerative disorders: GGGGCC (G 4 C 2 ) hexanucleotide repeat expansions in C9orf72 that cause amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia (C9 ALS/FTD) and CGG repeat expansions in FMR1 that cause Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome. We found that HCR of both G 4 C 2 and CGG repeats has comparable specificity to traditional FISH, but is >40x more sensitive and shows repeat-length dependence in its intensity. HCR is better than FISH at detecting both nuclear and cytoplasmic foci in human C9 ALS/FTD fibroblasts, patient iPSC derived neurons, and patient brain samples. We used HCR to determine the impact of integrated stress response (ISR) activation on RNA foci number and distribution. G 4 C 2 repeat RNA did not readily co-localize with the stress granule marker G3BP1, but ISR induction increased both the number of detectible nuclear RNA foci and the nuclear/cytoplasmic foci ratio in patient fibroblasts and patient derived neurons. Taken together, these data suggest that HCR can be a useful tool for detecting repeat expansion mRNA in C9 ALS/FTD and other repeat expansion disorders.

Abstract An intronic hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 causes familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). This repeat is thought to elicit toxicity through RNA mediated protein sequestration and repeat-associated non-AUG (RAN) translation of dipeptide repeat proteins (DPRs). We generated a series of transgenic Drosophila models expressing GGGGCC (G 4 C 2 ) repeats either inside of an artificial intron within a GFP reporter or within the 5’ UTR of GFP placed in different downstream reading frames. Expression of 484 intronic repeats elicited minimal alterations in eye morphology, viability, longevity, or larval crawling but did trigger RNA foci formation, consistent with prior reports. In contrast, insertion of repeats into the 5’ UTR elicited differential toxicity that was dependent on the reading frame of GFP relative to the repeat. Greater toxicity correlated with a short and unstructured carboxyl terminus in the glycine-arginine (GR) RAN protein reading frame. This change in C-terminal sequence triggered nuclear accumulation of all three RAN DPRs. A similar differential toxicity and dependence on the GR carboxyl terminus was observed when repeats were expressed in rodent neurons. The presence of the native carboxyl-termini across all three reading frames was partly protective. Taken together, these findings suggest that carboxyl terminal sequences outside of the repeat region may alter the behavior and toxicity of dipeptide repeat proteins derived from GGGGCC repeats.