Methylation at the 6 position of adenosine (m6A) in RNA is rapidly and transiently induced at DNA damage sites in response to ultraviolet irradiation. UV light can damage DNA and be a threat to cell survival. The cells respond to this threat by identifying DNA lesions, excising the affected nucleotides and synthesizing new DNA at the site of damage. Yang Shi and colleagues report that polyadenylated RNAs—RNAs to which a tail of adenosines has been added as part of their maturation into functional messenger RNAs—undergo a specific modification when they are close to DNA that has been damaged by UV light. This modification, which consists in the addition of a methyl group to the N6 position of adenosine, is promoted by the METTL3 methyltransferase and suppressed by the FTO demethylase. This RNA modification regulates the DNA repair process, which is delayed in the absence of METTL3. Importantly, the modification helps to recruit the trans-lesion repair DNA polymerase, pol κ, to the damaged DNA site. This study uncovers a new cellular role for this RNA modification. Cell proliferation and survival require the faithful maintenance and propagation of genetic information, which are threatened by the ubiquitous sources of DNA damage present intracellularly and in the external environment. A system of DNA repair, called the DNA damage response, detects and repairs damaged DNA and prevents cell division until the repair is complete. Here we report that methylation at the 6 position of adenosine (m6A) in RNA is rapidly (within 2 min) and transiently induced at DNA damage sites in response to ultraviolet irradiation. This modification occurs on numerous poly(A)+ transcripts and is regulated by the methyltransferase METTL3 (methyltransferase-like 3)1 and the demethylase FTO (fat mass and obesity-associated protein)2. In the absence of METTL3 catalytic activity, cells showed delayed repair of ultraviolet-induced cyclobutane pyrimidine adducts and elevated sensitivity to ultraviolet, demonstrating the importance of m6A in the ultraviolet-responsive DNA damage response. Multiple DNA polymerases are involved in the ultraviolet response, some of which resynthesize DNA after the lesion has been excised by the nucleotide excision repair pathway3, while others participate in trans-lesion synthesis to allow replication past damaged lesions in S phase4. DNA polymerase κ (Pol κ), which has been implicated in both nucleotide excision repair and trans-lesion synthesis5,6, required the catalytic activity of METTL3 for immediate localization to ultraviolet-induced DNA damage sites. Importantly, Pol κ overexpression qualitatively suppressed the cyclobutane pyrimidine removal defect associated with METTL3 loss. Thus, we have uncovered a novel function for RNA m6A modification in the ultraviolet-induced DNA damage response, and our findings collectively support a model in which m6A RNA serves as a beacon for the selective, rapid recruitment of Pol κ to damage sites to facilitate repair and cell survival.

The cell stress-responsive transcription factor p53 influences the expression of its target genes and subsequent cellular responses based in part on its dynamics (changes in level over time). The mechanisms decoding p53 dynamics into subsequent target mRNA and protein dynamics remain unclear. We systematically quantified p53 target mRNA and protein expression over time under two p53 dynamical regimes, oscillatory and rising, using RNA-sequencing and TMT mass spectrometry. Oscillatory dynamics allowed for a greater variety of dynamical patterns for both mRNAs and proteins. Mathematical modeling of empirical data revealed three distinct mechanisms that decode p53 dynamics. Specific combinations of these mechanisms at the transcriptional and post-transcriptional levels enabled exclusive induction of proteins under particular dynamics. In addition, rising induction of p53 led to higher induction of proteins regardless of their functional class, including proteins promoting arrest of proliferation, the primary cellular outcome under rising p53. Our results highlight the diverse mechanisms cells employ to distinguish complex transcription factor dynamics to regulate gene expression.

Abstract Stem cells integrate information from multiple signals in their environment to make fate decisions. It is unclear how signal integration is linked to the coordinated activation of a target fate program and simultaneous inactivation of competing fates. Here, we investigated this question in mouse neural stem cells, which differentiate synergistically into astrocytes in response to combined treatment with Bone Morphogenetic Protein (BMP) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) at the expense of alternative neuronal or oligodendrocyte fates. Analysis of the expression dynamics of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), an early astrocyte marker, showed that its synergistic activation in BMP and LIF reflects early activation by LIF which is sustained by a delayed contribution to its expression from BMP. In parallel, multiplexed RNA-FISH analysis of 14 basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors, known to regulate alternative fates, showed that LIF and BMP individually control different subsets of bHLHs, but together suppress all bHLHs known to promote alternative fates. Ectopic expression experiments showed that these bHLHs also inhibit GFAP induction, suggesting that suppression of alternative fates by BMP + LIF simultaneously relieves GFAP inhibition. In particular, BMP primarily affected inhibitory bHLHs indirectly, through induction of Id factors, explaining why it has a delayed contribution to GFAP transcription compared to LIF. These results show that a circuit of bHLH factors enables both synergistic astrocytic differentiation and suppression of alternative fates in NSCs. Signal integration by bHLH circuits for fate choice could be broadly relevant, given the widespread utilization of these and other bHLH factors across diverse developmental contexts.

Abstract The midbody (MB) is a transient structure at the spindle midzone that is required for cytokinesis, the terminal stage of cell division. Long ignored as a vestigial remnant of cytokinesis, we now know MBs are released post-abscission as extracellular vesicles called MB remnants (MBRs) and can modulate cell proliferation, fate decisions, tissue polarity, neuronal architecture, and tumorigenic behavior. Here, we demonstrate that the MB matrix—the structurally amorphous MB core of unknown composition—is the site of ribonucleoprotein assembly and is enriched in mRNAs that encode proteins involved in cell fate, oncogenesis, and pluripotency, that we are calling the MB granule. Using a quantitative transcriptomic approach, we identified a population of mRNAs enriched in mitotic MBs and confirmed their presence in signaling MBR vesicles released by abscission. The MB granule is unique in that it is translationally active, contains both small and large ribosomal subunits, and has both membrane-less and membrane-bound states. Both MBs and post-abscission MBRs are sites of spatiotemporally regulated translation, which is initiated when nascent daughter cells re-enter G1 and continues after extracellular release. We demonstrate that the MB is the assembly site of an RNP granule. MKLP1 and ARC are necessary for the localization and translation of RNA in the MB dark zone, whereas ESCRT-III was necessary to maintain translation levels in the MB. Our data suggest a model in which the MB functions as a novel RNA-based organelle with a uniquely complex life cycle. We present a model in which the assembly and transfer of RNP complexes are central to post-mitotic MBR function and suggest the MBR serves as a novel mode of RNA-based intercellular communication with a defined biogenesis that is coupled to abscission, and inherently links cell division status with signaling capacity. To our knowledge, this is the first example of an autonomous extracellular vesicle with active translation activity. Highlights The MB, the center region of the intercellular bridge, is the assembly site of a ribonucleoprotein granule, we call the MB granule Distinct oncogenic and pluripotent transcription factor RNAs, including Jun/Fos and KLF4 , are packaged in MBs and MBRs The MB granule is coincident with the MB matrix, or dark zone, of the MB The Kif23/MKLP1 kinesin is a core hexanediol-sensitive MB granule component The MB and MBR are site of active translation that begins in early G1 and continues post-mitotically MKLP1 and ARC are necessary for RNA targeting/maintenance and translation at the MB Depletion of ESCRT-III increases the levels of translation during abscission Abscission releases MBRs as MB granule-harboring, translating extracellular vesicles Multiple cell types including cancer, stem, neural stem, all have actively translating MBRs MBRs are proposed as a novel mode of intercellular communication by extracellular vesicle-mediated direct transfer of RNA

SUMMARY Oncogene-induced senescence (OIS) is a phenomenon in which aberrant oncogene expression causes non-transformed cells to enter a non-proliferative state. Cells undergoing OIS display phenotypic heterogeneity, with some cells senescing and others remaining proliferative. The causes of the heterogeneity remain poorly understood. We studied the sources of heterogeneity in the responses of human epithelial cells to oncogenic BRAF V600E expression. We found that a narrow expression range of BRAF V600E generated a wide range of activities of its downstream effector ERK. In population-level and single cell assays, ERK activity displayed a non-monotonic relationship to proliferation, with intermediate ERK activities leading to maximal proliferation. We profiled gene expression across a range of ERK activities over time and characterized four distinct ERK response classes, which we propose act in concert to generate the unique ERK-proliferation response. Altogether, our studies mapped the input-output relationships between ERK activity and proliferation providing important insights into how heterogeneity can be generated during OIS.

Summary Stem and progenitor cells have the capacity to balance self-renewal and differentiation. Hematopoietic myeloid progenitors replenish more than 25 billion terminally differentiated neutrophils every day under homeostatic conditions and can increase this output in response to stress or infection. At what point along the spectrum of maturation do progenitors lose capacity for self-renewal and become irreversibly committed to differentiation? Using a system of conditional myeloid development that can be toggled between self-renewal and differentiation, we interrogated determinants of this ‘point of no return’ in differentiation commitment. Irreversible commitment is due primarily to loss of open regulatory site access and disruption of a positive feedback transcription factor activation loop. Restoration of the transcription factor feedback loop extends the window of cell plasticity and alters the point of no return. These findings demonstrate how the chromatin state enforces and perpetuates cell fate and identifies potential avenues for manipulating cell identity. Highlights There exists a point of irreversible commitment in granulocytic differentiation Chromatin state dynamics establish the transition from self-renewal to differentiation commitment Reduced chromatin accessibility underlies an irreversible loss of regulatory site access Restoration of a transcription factor feedback loop alters the differentiation commitment point

Abstract Motivation Post-translational modifications (PTMs) on proteins regulate protein structures and functions. A single protein molecule can possess multiple modification sites that can accommodate various PTM types, leading to a variety of different patterns, or combinations of PTMs, on that protein. Different PTM patterns can give rise to distinct biological functions. To facilitate the study of multiple PTMs on the same protein molecule, top-down mass spectrometry (MS) has proven to be a useful tool to measure the mass of intact proteins, thereby enabling even PTMs at distant sites to be assigned to the same protein molecule and allowing determination of how many PTMs are attached to a single protein. Results We developed a Python module called MSModDetector that studies PTM patterns from individual ion mass spectrometry (I2MS) data. I2MS is an intact protein mass spectrometry approach that generates true mass spectra without the need to infer charge states. The algorithm first detects and quantifies mass shifts for a protein of interest and subsequently infers potential PTM patterns using linear programming. The algorithm is evaluated on simulated I2MS data and experimental I2MS data for the tumor suppressor protein p53. We show that MSModDetector is a useful tool for comparing a protein’s PTM pattern landscape across different conditions. An improved analysis of PTM patterns will enable a deeper understanding of PTM-regulated cellular processes. Availability and implementation The source code is available at https://github.com/marjanfaizi/MSModDetector.

Genetically identical cells can respond heterogeneously to cancer therapy, with a subpopulation of cells often entering a temporarily arrested treatment-tolerant state before repopulating the tumor. To investigate how heterogeneity in the cell cycle arrest protein p21 arises, we imaged the dynamics of p21 transcription and protein expression along with those of p53, its transcriptional regulator, in single cells using live cell fluorescence microscopy. Surprisingly, we found that the rate of p21 transcription depends on the change in p53 rather than its absolute level. Through combined theoretical and experimental modeling, we determined that p21 transcription is governed by an incoherent feedforward loop mediated by MDM2. This network architecture facilitates rapid induction of p21 expression and variability in p21 transcription. Abrogating the feedforward loop overcomes rapid S-phase p21 degradation, with cells transitioning into a quiescent state that transcriptionally resembles a treatment-tolerant persister state. Our findings have important implications for therapeutic strategies based on activating p53.

Abstract Motivation Post-translational modifications (PTMs) on proteins regulate protein structures and functions. A single protein molecule can possess multiple modification sites that can accommodate various PTM types, leading to a variety of different patterns, or combinations of PTMs, on that protein. Different PTM patterns can give rise to distinct biological functions. To facilitate the study of multiple PTMs, top-down mass spectrometry (MS) has proven to be a useful tool to measure the mass of intact proteins, thereby enabling even widely separated PTMs to be assigned to the same protein molecule and allowing determination of how many PTMs are attached to a single protein. Results We developed a Python module called MSModDetector that studies PTM patterns from individual ion mass spectrometry (I MS) data. I MS is an intact protein mass spectrometry approach that generates true mass spectra without the need to infer charge states. The algorithm first detects and quantifies mass shifts for a protein of interest and subsequently infers potential PTM patterns using linear programming. The algorithm is evaluated on simulated I MS data and experimental I MS data for the tumor suppressor protein p53. We show that MSModDetector is a useful tool for comparing a protein’s PTM pattern landscape across different conditions. An improved analysis of PTM patterns will enable a deeper understanding of PTM-regulated cellular processes. Availability The source code is available at https://github.com/marjanfaizi/MSModDetector together with the scripts used for analyses and to generate the figures presented in this study.