Abstract α-Synuclein (α-syn) fibrillar aggregates are the major component of Lewy bodies and Lewy neurites presenting as the pathology hallmark of Parkinson’s disease (PD). Studies have shown that α-syn is potential to form different conformational fibrils associated with different synucleinopathies, but whether the conformation of α-syn fibrils changes in different phases of related diseases is to be explored. Here, we amplified α-syn aggregates from the cerebrospinal fluid (CSF) of preclinical (pre-PD) and late-stage postmortem PD (post-PD) patients. Our results show that compared to the CSF of pre-PD, that of post-PD is markedly stronger in seeding in vitro α-syn aggregation, and the amplified fibrils are more potent in inducing endogenous α-syn aggregation in neurons. Cryo-electron microscopic structures further reveal that the difference between the pre-PD- and post-PD-derived fibrils lies on a minor polymorph which in the pre-PD fibrils is morphologically straight, while in the post-PD fibrils represents a single protofilament assembled by a distinctive conformation of α-syn. Our work demonstrates structural and pathological differences between pre-PD and post-PD α-syn aggregation and suggests potential alteration of α-syn fibrils during the progression of PD clinical phases. Significance Statement Increasing evidence support different conformational α-syn fibrils in patients with different α-synucleinopathies, but whether the conformation of α-syn fibrils changes in different phases of related diseases is unknown. Here, we show that α-syn fibrils amplified from the cerebrospinal fluid (CSF) of the late-stage postmortem PD (post-PD) patient are more potent in inducing endogenous α-syn aggregation in neurons than that amplified from the preclinical (pre-PD) patient. Cryo-EM structures further reveal that the post-PD fibrils contain a novel conformation that is distinct from either the pre-PD fibrils or those previously reported. Our work suggests conformational evolution of α-syn fibrils along with PD progression.

Abstract Human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1) serves as a key regulating protein in RNA metabolism. Malfunction of hnRNPA1 in nucleo-cytoplasmic transport or dynamic phase separation leads to abnormal amyloid aggregation and neurodegeneration. The low complexity (LC) domain of hnRNPA1 drives both dynamic phase separation and amyloid aggregation. Here, we use cryo-electron microscopy to determine the amyloid fibril structure formed by hnRNPA1 LC domain. Remarkably, the structure reveals that the nuclear localization sequence of hnRNPA1 (termed PY-NLS), which is initially known to mediate the nucleo-cytoplamic transport of hnRNPA1 through binding with karyopherin-β2 (Kapβ2), represents the major component of the fibril core. The residues that contribute to the binding of PY-NLS with Kapβ2 also exert key molecular interactions to stabilize the fibril structure. Notably, hnRNPA1 mutations found in familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and multisystem proteinopathoy (MSP) are all involved in the fibril core and contribute to fibril stability. Our work illuminate structural understandings on the pathological amyloid aggregation of hnRNPA1 and the amyloid disaggregase activity of Kapβ2, and highlights the multiple roles of PY-NLS in hnRNPA1 homeostasis.

Prion diseases are caused by the conformational conversion of prion protein (PrP) from its cellular form (PrP C ) into a protease-resistant, aggregated form (PrP Sc ). 42 different familial mutations were identified in human PrP, which lead to genetic prion diseases with distinct clinical syndromes. Here we report cryo-EM structure of an amyloid fibril formed by full-length human PrP with E196K mutation, a familial Creutzfeldt-Jakob disease-related mutation. This mutation disrupts key interactions in wild-type PrP fibril and results in a rearrangement of the overall structure, forming an amyloid fibril with a conformation distinct from wild-type PrP fibril. The E196K fibril consists of two protofibrils intertwined into a left-handed helix. Each subunit forms five β-strands stabilized by a disulfide bond and an unusual hydrophilic cavity. Two pairs of amino acids (Lys194 and Glu207; Lys196 and Glu200) from opposing subunits form four salt bridges to stabilize the zigzag interface of the two protofibrils. Furthermore, the E196K fibril exhibits a significantly lower conformational stability and protease resistance activity than the wild-type fibril. Our results provide direct structural evidences of the diverse mammalian prion strains and fibril polymorphism of PrP, and highlight the importance of familial mutations in determining the different prion strains.

ABSTRACT TAR DNA binding protein 43 kDa (TDP-43) undergoes liquid-liquid phase separation (LLPS) and forms reversible, cytoprotective nuclear bodies (NBs) in response to stress in cells. Abnormal liquid-to-solid phase transition condenses TDP-43 into irreversible pathological fibrils, which is associated with neurodegenerative disorders including amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal degeneration (FTD). However, the mechanisms how cells maintain the dynamics of TDP-43 NBs in stressed conditions are not well understood. Here, we show that the molecular chaperon heat shock protein 70 (Hsp70) is recruited into TDP-43 NBs in stressed cells. It co-phase separates with TDP-43 and delays the maturation of TDP-43 droplets in vitro . In cells, downregulation of Hsp70 not only diminishes the formation but also reduces the dynamics of TDP-43 NBs especially during prolonged stress, which potentiates the cytotoxicity of TDP-43. Using NMR, we reveal that Hsp70 binds to the highly aggregation-prone, transient α-helix of TDP-43 via its nucleotide-binding domain, which keeps TDP-43 in the highly dynamic, liquid-like phase and prevents pathological aggregation of TDP-43 both in vitro and in cells. Collectively, our findings demonstrate a crucial role of Hsp70 in chaperoning TDP-43 in the liquid-like phase, which provides a novel layer of the molecular mechanism how chaperons help proteins to remain functional and protect cells from stressed and/or diseased conditions.

Post-translational modifications (PTMs) of α-synuclein (α-syn), e.g. phosphorylation, play an important role in modulating α-syn pathology in Parkinson's disease (PD) and α-synucleinopathies. Accumulation of phosphorylated α-syn fibrils in Lewy bodies and Lewy neurites is the histological hallmark of these diseases. However, it is unclear how phosphorylation relates to α-syn pathology. Here, by combining chemical synthesis and bacterial expression, we obtained homogeneous α-syn fibrils with site-specific phosphorylation at Y39, which exhibits enhanced neuronal pathology in rat primary cortical neurons. We determined the cryo-EM structure of pY39 α-syn fibril, which reveals a new fold of α-syn with pY39 in the center of the fibril core forming electrostatic interaction network with eight charged residues in the N-terminal region of α-syn. This structure composed of residues 1-100 represents the largest α-syn fibril core determined so far. This work provides structural understanding on the pathology of pY39 α-syn fibril, and highlights the importance of PTMs in defining the polymorphism and pathology of amyloid fibrils in neurodegenerative diseases.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

α-Synuclein (α-syn) amyloid fibril, as the major component of Lewy bodies and pathological entity spreading in human brain, is closely associated with Parkinson’s disease (PD) and other synucleinopathies. Several single amino-acid mutations (e.g. E46K) of α-syn have been identified causative to the early onset of familial PD. Here, we determined the cryo-EM structure of a full-length α-syn fibril formed by N-terminal acetylated E46K mutant α-syn (Ac-E46K). The fibril structure represents a new fold of α-syn, which demonstrates that the E46K mutation breaks the electrostatic interactions in the wild type (WT) α-syn fibril and thus triggers the rearrangement of the overall structure. Furthermore, we show that the Ac-E46K fibril is less resistant to harsh conditions and protease cleavage, and more prone to be fragmented with a higher capability of seeding fibril formation than that of the WT fibril. Our work provides a structural view to the severe pathology of the PD familial mutation E46K of α-syn and highlights the importance of electrostatic interactions in defining the fibril polymorphs.

ABSTRACT α-Synuclein (α-syn) forms amyloid fibrils that are critical in the progression of Parkinson’s disease (PD) and serves as the pathological hallmark of PD. Different posttranslational modifications (PTMs) have been identified at multiple sites of α-syn, influencing its conformation, aggregation and function. Here, we investigate how disease-related phosphorylation and O-GlcNAcylation at the same α-syn site (S87) affect fibril structure and neuropathology. Using semi-synthesis, we obtained homogenous α-syn monomer with site-specific phosphorylation (pS87) and O-GlcNAcylation (gS87) at S87, respectively. Cryo-EM analysis revealed that pS87 and gS87 α-syn form two novel but distinct fibril structures. The GlcNAc situated at S87 establishes interactions with K80 and E61, inducing a unique iron-like fold with the GlcNAc molecule on the iron handle. While, phosphorylation at the same site prevents a lengthy C-terminal region including residues 73-140 from incorporating into the fibril core due to electrostatic repulsion. Instead, the N-terminal half (1-72) shapes a novel arch-like fibril structure. We further show that both pS87 and gS87 α-syn fibrils display reduced neurotoxicity and propagation activity compared with unmodified α-syn fibril. Our findings demonstrate that different PTMs at the same site can produce distinct fibril structures, which emphasizes the precise regulation of PTMs to amyloid fibril formation and pathology.