Comprehensive libraries of plasmids for SARS-CoV-2 proteins with various tags (e.g. Strep, HA, Turbo) are now available. They enable the identification of numerous potential protein-protein interactions between the SARS-CoV-2 virus and host proteins. To facilitate further cellular investigations, notably by imaging techniques, we present here a large library of SARS CoV-2 protein constructs fused with green and red fluorescent proteins and their initial characterization in various human cell lines including lung epithelial cell models (A549, BEAS-2B), as well as in budding yeast. The localization of a few SARS-CoV-2 proteins matches their proposed interactions with host proteins. These include the localization of Nsp13 to the centrosome, Orf3a to late endosomes, and Orf9b to mitochondria.

Abstract Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is an inherited disease of the sarcomere resulting in excessive cardiac contractility. The first-in-class cardiac myosin inhibitor, mavacamten, improves symptoms in obstructive HCM. Here we present aficamten, a selective small-molecule inhibitor of cardiac myosin that diminishes ATPase activity by strongly slowing phosphate release, stabilizing a weak actin-binding state. Binding to an allosteric site on the myosin catalytic domain distinct from mavacamten, aficamten prevents the conformational changes necessary to enter the strongly actin-bound force-generating state. In doing so, aficamten reduces the number of functional myosin heads driving sarcomere shortening. The crystal structure of aficamten bound to cardiac myosin in the pre-powerstroke state provides a basis for understanding its selectivity over smooth and fast skeletal muscle. Furthermore, in cardiac myocytes and in mice bearing the hypertrophic R403Q cardiac myosin mutation, aficamten reduces cardiac contractility. Our findings suggest aficamten holds promise as a therapy for HCM.

Emerging evidences suggest that both function and position of organelles are pivotal for tumor cell dissemination. Among them, lysosomes stand out as they integrate metabolic sensing with gene regulation and secretion of proteases. Yet, how the function of lysosomes is linked to their position and how this controls metastatic progression remains elusive. Here, we analyzed lysosome subcellular distribution in micropatterned patient-derived melanoma cells and found that lysosome spreading scales with their aggressiveness. Peripheral lysosomes promote invadopodia-based matrix degradation and invasion of melanoma cells which is directly linked to their lysosomal and cell transcriptional programs. When controlling lysosomal positioning using chemo-genetical heterodimerization in melanoma cells, we demonstrated that perinuclear clustering impairs lysosomal secretion, matrix degradation and invasion. Impairing lysosomal spreading in a zebrafish metastasis model significantly reduces invasive outgrowth. Our study provides a mechanistic demonstration that lysosomal positioning controls cell invasion, illustrating the importance of organelle adaptation in carcinogenesis.

Abstract Lysosomal exocytosis is involved in many key cellular processes but its spatio-temporal regulation is poorly known. Using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) and spatial statistics, we observed that lysosomal exocytosis is not random at the adhesive part of the plasma membrane of RPE1 cells but clustered at different scales. Although the rate of exocytosis is regulated by the actin cytoskeleton, neither interfering with actin or microtubule dynamics by drug treatments alters its spatial organization. Exocytosis events partially co-appear at focal adhesions (FAs) and their clustering is reduced upon removal of FAs. Changes in membrane tension following a hypo-osmotic shock or treatment with methyl-β-cyclodextrin was found to increase clustering. To investigate the link between FAs and membrane tension, cells were cultured on adhesive ring-shaped micropatterns, which allows to control the spatial organization of FAs. By using a combination of TIRFM and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) microscopy, we revealed the existence of a radial gradient in membrane tension. By changing the diameter of micropatterned substrates, we further showed that this gradient as well as the extent of exocytosis clustering can be controlled. Together, our data indicate that the spatial clustering of lysosomal exocytosis relies on membrane tension patterning controlled by the spatial organization of FAs.

Abstract Migrating cells present a variety of paths, from random to highly directional ones. While random movement can be explained by basal intrinsic activity, persistent movement requires stable polarization. Here, we quantitatively address emergence of persistent migration in RPE1 cells over long timescales. By live-cell imaging and dynamic micropatterning, we demonstrate that the Nucleus-Golgi axis aligns with direction of migration leading to efficient cell movement. We show that polarized trafficking is directed towards protrusions with a 20 min delay, and that migration becomes random after disrupting internal cell organization. Eventually, we prove that localized optogenetic Cdc42 activation orients the Nucleus-Golgi axis. Our work suggests that polarized trafficking stabilizes the protrusive activity of the cell, while protrusive activity orients this polarity axis, leading to persistent cell migration. Using a minimal physical model, we show that this feedback is sufficient to recapitulate the quantitative properties of cell migration in the timescale of hours.

We aim at the identification of myosin motor proteins that control trafficking at the Golgi apparatus. In addition to the known Golgi-associated myosins MYO6, MYO18A and MYH9 (myosin IIA), we identify MYO1C as a novel player at the Golgi. We demonstrate that depletion of MYO1C induces Golgi apparatus fragmentation and decompaction. MYO1C accumulates at dynamic structures around the Golgi apparatus that colocalize with Golgi-associated actin dots. Interestingly, MYO1C depletion leads to loss of cellular F-actin, and Golgi apparatus decompaction is also observed after the inhibition or loss of the Arp2/3 complex. We show that the functional consequences of MYO1C depletion is a delay in the arrival of incoming transport carriers, both from the anterograde and retrograde routes. We propose that MYO1C stabilizes branched actin at the Golgi apparatus that facilitates the arrival of incoming transport at the Golgi.

Segmentation and detection of biological objects in fluorescence microscopy is of paramount importance in cell imaging. Deep learning approaches have recently shown promise to advance, automatize and accelerate analysis. However, most of the interest has been given to the segmentation of static objects of 2D/3D images whereas the segmentation of dynamic processes obtained from time-lapse acquisitions has been less explored. Here we adapted DeepFinder, a U-net originally designed for 3D noisy cryo-electron tomography (cryo-ET) data, for the detection of rare dynamic exocytosis events (termed ExoDeepFinder) observed in temporal series of 2D Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM) images. ExoDeepFinder achieved good absolute performances with a relatively small training dataset of 60 cells/~12000 events. We rigorously compared deep learning performances with unsupervised conventional methods from the literature. ExoDeepFinder outcompeted the tested methods, but also exhibited a greater plasticity to the experimental conditions when tested under drug treatments and after changes in cell line or imaged reporter. This robustness to unseen experimental conditions did not require re-training demonstrating generalization capability of ExoDeepFinder. ExoDeepFinder, as well as the annotated training datasets, were made transparent and available through an open-source software as well as a Napari plugin and can directly be applied to custom user data. The apparent plasticity and performances of ExoDeepFinder to detect dynamic events open new opportunities for future deep-learning guided analysis of dynamic processes in live-cell imaging.

Abstract Lysosomes orchestrate degradation and recycling of exogenous and endogenous material, thus controlling cellular homeostasis. Little is known how this organelle changes during malignant transformation. We investigate the intracellular landscape of lysosomes in a cellular model of bladder cancer. Employing standardized cell culture on micropatterns we identify a phenotype of peripheral lysosome positioning prevailing in bladder cancer but not normal urothelium. We show that lysosome positioning is controlled by transcription factor EB (TFEB) and that lysosomal dispersion results from TFEB activation downstream of lysosomal Ca 2+ release. Remarkably, we find that TFEB regulates phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) levels on endomembranes which recruit FYVE-domain containing proteins, such as the motor adaptor protrudin, for anterograde movement of lysosomes. Altogether, we uncover lysosome positioning as result of PtdIns3P activation downstream of TFEB as a potential biomarker for bladder cancer. Moreover, we reveal a novel role of TFEB in regulating cellular PtdIns levels, conceptually clarifying the dual role of TFEB as regulator of endosomal maturation and autophagy, two distinct processes controlled by PtdIns3P. Statement of significance Here we provide the first atlas for the landscape of the lysosomal compartment in bladder cancer and reveal the mechanistic role of TFEB in regulating endosomal PtdIns3P levels and subsequent lysosomal dispersion. We unveiled lysosomal positioning as a potential biomarker for malignant bladder cancer which might arise as an actionable target for cancer therapy.