Abstract The role of antagonistic secondary metabolites produced by Pseudomonas protegens in suppression of soil-borne phytopathogens has been clearly documented. However, their contribution to the ability of P. protegens to establish in soil and rhizosphere microbiomes remains less clear. Here, we use a four-species synthetic community (SynCom) in which individual members are sensitive towards key P. protegens antimicrobial metabolites (DAPG, pyoluteorin, and orfamide A) to determine how antibiotic production contributes to P. protegens community invasion and to identify community traits that counteract the antimicrobial effects. We show that P. protegens readily invades and alters the SynCom composition over time, and that P. protegens establishment requires production of DAPG and pyoluteorin. An orfamide A-deficient mutant of P. protegens invades the community as efficiently as wildtype, and both cause similar perturbations to community composition. Here, we identify the microbial interactions underlying the absence of an orfamide A mediated impact on the otherwise antibiotic-sensitive SynCom member, and show that the cyclic lipopeptide is inactivated and degraded by the combined action of Rhodococcus globerulus D757 and Stenotrophomonas indicatrix D763. Altogether, the demonstration that the synthetic community constrains P. protegens invasion by detoxifying its antibiotics may provide a mechanistic explanation to inconsistencies in biocontrol effectiveness in situ.

Abstract The role of antagonistic secondary metabolites produced by Pseudomonas protegens in suppression of soil-borne phytopathogens has been clearly documented. However, their contribution to the ability of P. protegens to establish in soil and rhizosphere microbiomes remains ambiguous. Here, we use a four-species synthetic community to determine how antibiotic production contributes to P. protegens community invasion and identify community traits that alter the abundance of key P. protegens antimicrobial metabolites (DAPG, pyoluteorin and orfamide A). Surprisingly, mutants deficient in antimicrobial production caused similar perturbations in community composition compared to invasion by wildtype P. protegens . Intriguingly, while pyoluteorin and orfamide A are secreted at levels toxic to individual bacterial strains, community-level resistance circumvents toxicity. Here, we identify the underlying mechanism by which the cyclic lipopeptide, orfamide A, is inactivated and degraded by Rhodococcus globerulus D757 and Stenotrophomonas indicatrix D763. Altogether, the demonstration that the synthetic community constrains P. protegens invasion by detoxifying its antibiotics may provide a mechanistic explanation to inconsistencies in biocontrol effectiveness in situ .

ABSTRACT Fluorescent Pseudomonas spp. producing the antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) are ecologically important in the rhizosphere as they can control phytopathogens and contribute to disease suppressiveness. While studies of DAPG-producing Pseudomonas have predominantly focused on rhizosphere niches, the ecological role of DAPG as well as the distribution and dynamics of DAPG-producing bacteria remains less well understood for other environments such as bulk soil and grassland, where the level of DAPG producers are predicted to be low. Here, we construct a whole cell biosensor for detection of DAPG and DAPG-producing bacteria from environmental samples. We show that the sensor is highly specific towards DAPG, with a sensitivity in the low nanomolar range (<20 nm). This sensitivity is comparable to the DAPG levels identified in rhizosphere samples by chemical analysis. The biosensor enables guided isolation of DAPG-producing Pseudomonas . Using the biosensor, we probed the same grassland soil sampling site to isolate genetically related DAPG-producing Pseudomonas kilonensis strains over a period of 12 months. Next, we used the biosensor to determine the frequency of DAPG-producing Pseudomonads within three different grassland soil sites and show that DAPG producers can constitute part of the Pseudomonas population in the range of 0.35-17% at these sites. Finally, we show that the biosensor enables detection of DAPG produced by non- Pseudomonas species. Our studies show that a whole-cell biosensor for DAPG detection can facilitate isolation of bacteria that produce this important secondary metabolite and provide insight into the population dynamics of DAPG producers in natural grassland soil. IMPORTANCE The interest has grown for bacterial biocontrol agents as biosustainable alternatives to pesticides to increase crop yields. Currently, we have a broad knowledge of antimicrobial compounds, such as DAPG, produced by bacteria growing in the rhizosphere surrounding plant roots. However, compared to the rhizosphere niches, the ecological role of DAPG as well as the distribution and dynamics of DAPG-producing bacteria remains less well understood for other environments such as bulk and grassland soil. Currently, we are restricted to chemical methods with detection limits and time-consuming PCR-based and probe-hybridization approaches to detect DAPG and its respective producer. In this study, we have developed a whole-cell biosensor, which can circumvent the labor-intensive screening process, as well as increase the sensitivity at which DAPG is detected. This enables quantification of relative amounts of DAPG-producers, which in turn increases our understanding of the dynamics and ecology of these producers in natural soil environments.

Abstract Bacilli and pseudomonads are among the most well-studied microorganisms commonly found in soil, and frequently co-isolated. Despite this, no systematic approach has been employed to assess the pairwise compatibility of members from these genera. Here, we screened 720 fluorescent soil isolates for their effects on Bacillus subtilis pellicle formation in two types of media and found a predictor for interaction outcome in Pseudomonas taxonomy. Interactions were context-dependent and both medium composition and culture conditions strongly influenced interactions. Negative interactions were associated with Pseudomonas capeferrum, Pseudomonas entomophila and Pseudomonas protegens , and 2,4-diacetylphloroglucinol was confirmed as a strong (but not exclusive) inhibitor of B. subtilis . Non-inhibiting strains were closely related to Pseudomonas trivialis and Pseudomonas lini , but in this case, cocultures with increased B. subtilis pellicle formation were spatially segregated. Our study is the first to propose an overall negative outcome from pairwise interactions between B. subtilis and fluorescent pseudomonads, hence cocultures comprising members from these groups are likely to require additional microorganisms for coexistence.

ABSTRACT Species of the genus Pseudomonas are used for several biotechnological purposes, including plant biocontrol and bioremediation. To exploit the Pseudomonas genus in environmental, agricultural or industrial settings, the organisms must be profiled at species level as their bioactivity potential differs markedly between species. Standard 16S rRNA gene amplicon profiling does not allow for accurate species differentiation. Thus, the purpose of this study was to develop an amplicon-based high-resolution method targeting a 760 nt region of the rpoD gene enabling taxonomic differentiation of Pseudomonas species in soil samples. The method was benchmarked on a sixteen membered Pseudomonas species mock community. All 16 species were correctly and semi-quantitatively identified using rpoD gene amplicons, whereas 16S rRNA V3V4 amplicon sequencing only correctly identified one species. We analysed the Pseudomonas profile in thirteen soil samples in northern Zealand, Denmark, where samples were collected from grassland (3 samples) and agriculture soil (10 samples). Pseudomonas species represented up to 0.7% of the microbial community, of which each sampling site contained a unique Pseudomonas composition. Thirty culturable Pseudomonas strains were isolated from each grassland site and ten from each agriculture site and identified by Sanger sequencing of the rpoD gene. In all cases, the rpoD -amplicon approach identified more species than found by cultivation, including hard-to-culture non-fluorescent pseudomonads, as well as more than found by 16S rRNA V3V4 amplicon sequencing. Thus, rpoD profiling can be used for species profiling of Pseudomonas , and large scale prospecting of bioactive Pseudomonas may be guided by initial screening using this method. Importance A high throughput sequence-based method for profiling of Pseudomonas species in soil microbiomes was developed and identified more species than 16S rRNA gene sequencing or cultivation. Pseudomonas species are used as biocontrol organisms and plant-growth promoting agents, and the method will allow tracing of specific species of Pseudomonas as well as enable screening of environmental samples for further isolation and exploitation.