Summary The evolution of independent lineages along replicated environmental gradients frequently results in convergent adaptation, yet the degree to which convergence is present across multiple levels of biological organization is often unclear. Additionally, inherent biases associated with shared ancestry and variation in selective regimes across geographic replicates often pose challenges for confidently identifying patterns of convergence. We investigated a system in which three species of poeciliid fishes sympatrically occur in a toxic spring rich in hydrogen sulfide (H 2 S) and an adjacent nonsulfidic stream to examine patterns of adaptive evolution across levels of biological organization. We found convergence in morphological and physiological traits and genome-wide patterns of gene expression among all three species. In addition, there were shared signatures of selection on genes encoding H 2 S toxicity targets in the mitochondrial genomes of each species. However, analyses of nuclear genomes revealed neither evidence for substantial genomic islands of divergence around genes involved in H 2 S toxicity and detoxification nor substantial congruence of strongly differentiated regions across population pairs. These non-convergent, heterogenous patterns of genomic divergence may indicate that sulfide tolerance is highly polygenic, with shared allele frequency shifts present at many loci with small effects along the genome. Alternatively, H 2 S tolerance may involve substantial genetic redundancy, with non-convergent lineage-specific variation at multiple loci along the genome underpinning similar changes in phenotypes and gene expression. Overall, we demonstrate variability in the extent of convergence across organizational levels and highlight the challenges of linking patterns of convergence across scales.

Regulating transcription allows organisms to respond to their environment, both within a single generation (plasticity) and across generations (adaptation). We examined transcriptional differences in gill tissues of fishes in the Poecilia mexicana species complex (family Poeciliidae), which have colonized toxic springs rich in hydrogen sulfide (H 2 S) in southern Mexico. There are gene expression differences between sulfidic and non-sulfidic populations, yet regulatory mechanisms mediating this gene expression variation remain poorly studied. We combined capped-small RNA sequencing (csRNA-seq), which captures actively transcribed (i.e. nascent) transcripts, and messenger RNA sequencing (mRNA-seq) to examine how variation in transcription, enhancer activity, and associated transcription factor binding sites may facilitate adaptation to extreme environments. csRNA-seq revealed thousands of differentially initiated transcripts between sulfidic and non-sulfidic populations, many of which are involved in H 2 S detoxification and response. Analyses of transcription factor binding sites in promoter and putative enhancer csRNA-seq peaks identified a suite of transcription factors likely involved in regulating H 2 S-specific shifts in gene expression, including several key transcription factors known to respond to hypoxia. Our findings uncover a complex interplay of regulatory processes that reflect the divergence of extremophile populations of P. mexicana from their non-sulfidic ancestors and suggest shared responses among evolutionarily independent lineages.

Abstract Visual sensitivity and body pigmentation are often shaped by both natural selection from the environment and sexual selection from mate choice. One way of quantifying the impact of the environment is by measuring how traits have changed after colonization of a novel habitat. To do this, we studied Poecilia mexicana populations that have repeatedly adapted to extreme sulphidic (H 2 S containing) environments. We measured visual sensitivity using opsin gene expression, as well as body pigmentation and water transmission for populations in four independent drainages. Both visual sensitivity and body pigmentation showed significant parallel shifts towards greater medium wavelength sensitivity and reflectance in sulphidic populations. The light spectrum was only subtly different between environments and overall, we found no significant correlations between the light environment and visual sensitivity or body pigmentation. Altogether we found that sulphidic habitats select for differences in visual sensitivity and pigmentation; our data suggest that this effect is unlikely to be driven purely by the water’s spectral properties and may instead be from other correlated ecological changes.

We compared the social dynamics of two populations of the live-bearing Atlantic molly (Poecilia mexicana) that live in adjacent habitats with very different predator regimes: cave mollies that inhabit a low-predation environment inside a sulfidic cave with a low density of predatory water bugs (Belostoma sp.), and mollies that live directly outside the cave (henceforth called “surface” mollies) in a high-predation environment with a high density of fish-eating birds. We filmed the social interactions of marked fish in both environments and analysed their social network dynamics using a Markov model under two different fish densities of 12 and 6 fish per 0.36 m2. As expected, surface mollies spent overall much more time social than cave mollies. This difference in overall social time was a result of surface mollies being less likely to discontinue social contact (once they had a social partner) and being more likely to resume social contact (once alone) than cave mollies. Interestingly surface mollies were also less likely to leave a current social partner than cave mollies. At low density, mollies (in both environments) were expected to show reduced social encounters which should dramatically change their social dynamics. Surface mollies, however, displayed an ability to maintain their social dynamics at low density (primarily by reducing the convex polygon spanned by the group) which was not observed in cave mollies. Despite the fact that we only compared two populations, our data provide a mechanistic explanation for density compensations of social dynamics that have also been observed in other fish species and give an example of how comparisons between the social dynamics of different populations can be made that go beyond conventional network analyses.

Extreme environments test the limits of life; yet, some organisms thrive in harsh conditions. Extremophile lineages inspire questions about how organisms can tolerate physiochemical stressors and whether the repeated colonization of extreme environments is facilitated by predictable and repeatable evolutionary innovations. We identified the mechanistic basis underlying convergent evolution of tolerance to hydrogen sulfide (H2S), a toxicant that impairs mitochondrial function, across evolutionarily independent lineages of a fish (Poecilia mexicana, Poeciliidae) from H2S-rich springs. Using comparative biochemical and physiological analyses, we found that mitochondrial function is maintained in the presence of H2S in sulfide spring P. mexicana, but not ancestral lineages from nonsulfidic habitats, due to convergent adaptations in the primary toxicity target and a major detoxification enzyme. Genome-wide local ancestry analyses indicated that convergent evolution of increased H2S tolerance in different populations is likely caused by a combination of selection on standing genetic variation and de novo mutations. At a macroevolutionary scale, H2S tolerance in 10 independent lineages of sulfide spring fishes across multiple genera of Poeciliidae is correlated with the convergent modification and expression changes of genes associated with H2S toxicity and detoxification. Our results demonstrate that the modification of highly conserved physiological pathways associated with essential mitochondrial processes mediates tolerance to physiochemical stress. In addition, the same pathways, genes, and in some instances codons are implicated in H2S adaptation in lineages that span 40 million years of evolution.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract The thermal ecology of ectotherm animals has gained considerable attention in the face of human induced climate change. Particularly in aquatic species the experimental assessment of critical thermal limits (CT min and CT max ) may help to predict possible effects of global warming on habitat suitability and ultimately species survival. Here we present data on the thermal limits of two endemic and endangered extremophile fish species, inhabiting a geothermally-heated and sulfur-rich spring system in Southern Mexico: The sulfur molly ( Poecilia sulphuraria ) and the widemouth gambusia ( Gambusia eurystoma ). Besides physiological challenges induced by toxic hydrogen sulfide and related severe hypoxia during the day, water temperatures have been previously reported to exceed those of nearby clearwater streams. We now present temperature data for various locations and years in the sulphur spring complex and conducted laboratory thermal tolerance tests (CT min and CT max ) both under normoxic as well as sever hypoxic conditions in both species. Average CT max limits did not differ between species under normoxic conditions. Surprisingly P. sulphuraria was found to reach a higher critical temperature (CT max = 43.2°C) when tested under hypoxic conditions, while G. eurystoma on average had a lower CT max when oxygen was absent. Based on this data we calculated both species’ thermal safety margins and used a TDT (thermal death time) model framework to relate our experimental data to observed temperatures in the natural habitat. Our findings suggest, that both species live near their thermal limits during the annual dry season and are locally already exposed to temperatures above their critical thermal limits. We discuss these findings in the light of possible physiological adaptions of the sulfur-adapted fish species and the anthropogenic threats for this unique system.

Adaptation to extreme environments often involves the evolution of dramatic physiological changes. To better understand how organisms evolve these complex phenotypic changes, the repeatability and predictability of evolution, and possible constraints on adapting to an extreme environment, it is important to understand how adaptive variation has evolved. Poeciliid fishes represent a particularly fruitful study system for investigations of adaptation to extreme environments due to their repeated colonization of toxic hydrogen sulfide-rich springs across multiple species within the clade. Previous investigations have highlighted changes in the physiology and gene expression in specific species that are thought to facilitate adaptation to hydrogen sulfide-rich springs. However, the presence of adaptive nucleotide variation in coding and regulatory regions and the degree to which convergent evolution has shaped the genomic regions underpinning sulfide tolerance across taxa are unknown. By sampling across seven independent lineages in which nonsulfidic lineages have colonized and adapted to sulfide springs, we reveal signatures of shared evolutionary rate shifts across the genome. We found evidence of genes, promoters, and putative enhancer regions associated with both increased and decreased convergent evolutionary rate shifts in hydrogen sulfide-adapted lineages. Our analysis highlights convergent evolutionary rate shifts in sulfidic lineages associated with the modulation of endogenous hydrogen sulfide production and hydrogen sulfide detoxification. We also found that regions with shifted evolutionary rates in sulfide spring fishes more often exhibited convergent shifts in either the coding region or the regulatory sequence of a given gene, rather than both.