Abstract Nuclear RNA binding proteins (RBPs) are difficult to study because they often belong to large protein families and form extensive networks of auto- and cross- regulation. They are highly abundant and often localize to condensates with a slow turnover, requiring long depletion times or knockouts that cannot distinguish between direct and indirect or compensatory effects. Here, we developed a system that is optimized for the rapid degradation of nuclear RBPs, called hGRAD. It comes as a ʹone-fits-allʹ plasmid, and integration into any cell line that expresses endogenously GFP-tagged proteins allows an inducible, rapid and complete knockdown. We show that the nuclear RBPs SRSF3, SRSF5, SRRM2 and NONO are completely cleared from nuclear speckles and paraspeckles within two hours. hGRAD works in various cell types, is more efficient than other methods and does not require the expression of exogenous ubiquitin ligases. Combining SRSF5 hGRAD degradation with Nascent-seq uncovered highly dynamic transient transcript changes, compensatory mechanisms and that SRSF5 promotes transcript stability.

Abstract Nuclear speckles (NS) and paraspeckles (PS) are adjacent condensates with distinct protein composition, with serine-arginine-rich splicing factors (SRSFs) concentrated in NS. Surprisingly, we find that SRSF5 is present in both. Combining super-resolution imaging, proximity proteomics and iCLIP, we show that SRSF5 binds with PS core proteins to the PS-scaffold RNA NEAT1 and locates between PS spheres. Acute SRSF5 depletion results in reduced PS with differently packaged NEAT1 . Under stress, SRSF5’s association with PS increases, and without SRSF5, PS cluster assembly is impaired. Interfering with binding to purine-rich RNAs even causes PS-NS fusion. In an intriguing over-compensation, longer SRSF5 depletion reduces TDP-43 levels via premature polyadenylation, leading to NEAT1 isoform switching and more PS. We propose that SRSF5 forms a stress-specific PS shell and acts as a glue for PS clusters. Additionally, we uncover SRSF5 as a novel regulator of TDP-43 and demonstrate how acute depletion distinguishes direct from compensatory effects. Highlights NS protein SRSF5 associates with PS shells and enriches between PS spheres SRSF5 binds the PS-scaffold RNA NEAT1 and ensures proper NEAT1 packaging SRSF5 association with PS increases under stress and promotes cluster formation Interfering with binding to purine-rich RNAs causes the fusion of PS and NS Acute SRSF5 depletion reveals compensatory effects on PS assembly and dynamics SRSF5 regulates TDP-43 levels via premature polyadenylation