Here, we describe a multiplexed immunohistochemical platform with computational image processing workflows, including image cytometry, enabling simultaneous evaluation of 12 biomarkers in one formalin-fixed paraffin-embedded tissue section. To validate this platform, we used tissue microarrays containing 38 archival head and neck squamous cell carcinomas and revealed differential immune profiles based on lymphoid and myeloid cell densities, correlating with human papilloma virus status and prognosis. Based on these results, we investigated 24 pancreatic ductal adenocarcinomas from patients who received neoadjuvant GVAX vaccination and revealed that response to therapy correlated with degree of mono-myelocytic cell density and percentages of CD8+ T cells expressing T cell exhaustion markers. These data highlight the utility of in situ immune monitoring for patient stratification and provide digital image processing pipelines to the community for examining immune complexity in precious tissue sections, where phenotype and tissue architecture are preserved to improve biomarker discovery and assessment.

Abstract Background Several stromal cell subtypes including macrophages contribute to tumor progression by inducing epithelial-mesenchymal transition (EMT) at the invasive front, a mechanism also linked to metastasis. Tumor associated macrophages (TAM) reside mainly at the invasive front but they also infiltrate tumors and in this process they mainly assume a tumor promoting phenotype. In this study, we asked if TAMs also regulate EMT intratumorally. We found that TAMs through TGF-β signaling and activation of the β-catenin pathway can induce EMT in intratumoral cancer cells. Methods We depleted macrophages in F9-teratocarcinoma bearing mice using clodronate-liposomes and analyzed the tumors for correlations between gene and protein expression of EMT-associated and macrophage markers. The functional relationship between TAMs and EMT was characterized in vitro in the murine F9 and mammary gland NMuMG cells, using a conditioned medium culture approach. The clinical relevance of our findings was evaluated on a tissue microarray cohort representing 491 patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Results Gene expression analysis of F9-teratocarcinomas revealed a positive correlation between TAM-densities and mesenchymal marker expression. Moreover, immunohistochemistry showed that TAMs cluster with EMT phenotype cells in the tumors. In vitro , long term exposure of F9-and NMuMG-cells to macrophage-conditioned medium led to decreased expression of the epithelial adhesion protein E-cadherin, activation of the EMT-mediating β-catenin pathway, increased expression of mesenchymal markers and an invasive phenotype. In a candidate based screen, macrophage-derived TGF-β was identified as the main inducer of this EMT-associated phenotype. Lastly, immunohistochemical analysis of NSCLC patient samples identified a positive correlation between intratumoral macrophage densities, EMT markers, intraepithelial TGF-β levels and tumor grade. Conclusions Data presented here identify a novel role for macrophages in EMT-promoted tumor progression. The observation that TAMs cluster with intra-epithelial fibroblastoid cells suggests that the role of macrophages in tumor-EMT extends beyond the invasive front. As macrophage infiltration and pronounced EMT tumor phenotype correlate with increased grade in NSCLC patients, we propose that TAMs also promote tumor progression by inducing EMT locally in tumors.

Abstract Majority of the eukaryotic cell surface is decorated with a layer of membrane attached polysaccharides and glycoproteins collectively referred to as the glycocalyx. While formation of a bulky glycocalyx has been associated with cancer progression, the mechanisms by which the glycocalyx regulates cancer invasiveness is incompletely understood. We address this question by first documenting sub-type specific expression of the major glycocalyx glycoprotein Mucin-1 (MUC1) in breast cancer patient samples and breast cancer cell lines. Strikingly, glycocalyx disruption led to inhibition of 2D motility, loss of 3D invasion and reduction of clonal scattering of breast cancer cells at the population level. Tracking of 2D cell motility and 3D invasiveness of MUC1-based sorted sub-populations revealed fastest motility and invasiveness in intermediate MUC1-expressing cells, with glycocalyx disruption abolishing these effects. While differential sensitivity in 2D motility is attributed to a non-monotonic dependence of focal adhesion size on MUC1 levels, higher MUC1 levels enhance 3D invasiveness via increased traction generation. In contrast to inducing cell rounding on collagen-coated substrates, high MUC1 level promotes cell adhesion and confers resistance to shear flow on substrates coated with the endothelial surface protein E-selectin. Collectively, our findings illustrate how MUC1 drives cancer invasiveness by differentially regulating cell-substrate adhesion in a substrate-dependent manner.

Gemcitabine is the first-line treatment option for patients with locally advanced or metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). However, the frequent adoption of resistance to gemcitabine by cancer cells poses a significant challenge in treating this aggressive disease. In this study, we focused on analyzing the role of trefoil factor 1 (TFF1) in gemcitabine resistance in PDAC. Analysis of PDAC TCGA and cell line datasets indicated an enrichment of TFF1 in the gemcitabine-resistant classical subtype and suggested an inverse correlation between TFF1 expression and sensitivity to gemcitabine treatment. The genetic ablation of TFF1 in PDAC cells enhanced their sensitivity to gemcitabine treatment in both in vitro and in vivo tumor xenografts. The biochemical studies revealed that TFF1 contributes to gemcitabine resistance through enhanced stemness, increasing migration ability of cancer cells, and induction of anti-apoptotic genes. We further pursued studies to predict possible receptors exerting TFF1-mediated gemcitabine resistance. Protein-protein docking investigations with BioLuminate software revealed that TFF1 binds to the chemokine receptor CXCR4, which was supported by real-time binding analysis of TFF1 and CXCR4 using SPR studies. The exogenous addition of TFF1 increased the proliferation and migration of PDAC cells through the pAkt/pERK axis, which was abrogated by treatment with a CXCR4-specific antagonist AMD3100. Overall, the present study demonstrates the contribution of the TFF1-CXCR4 axis in imparting gemcitabine resistance properties to PDAC cells.

Tumor-associated macrophages (TAMs) and other myelomonocytic cells are implicated in regulating responsiveness to immunotherapies, including immune checkpoint inhibitors (ICIs) targeting the PD-1/PD-L1 axis. We have developed an ex vivo high-throughput approach to discover modulators of macrophage-mediated T cell suppression, which can improve clinical outcomes of ICIs. We screened 1,430 Food and Drug Administration (FDA)-approved small-molecule drugs using a co-culture assay employing bone-marrow-derived macrophages (BMDMs) and splenic-derived T cells. This identified 57 compounds that disrupted macrophage-mediated T cell suppression. Seven compounds exerted prominent synergistic T cell expansion activity when combined with αPD-L1. These include four COX1/2 inhibitors and two myeloid cell signaling inhibitors. We demonstrate that the use of cyclooxygenase (COX)1/2 inhibitors in combination with αPD-L1 decreases tumor growth kinetics and enhances overall survival in triple-negative breast cancer (TNBC) tumor models in a CD8