Reliable inference of transcription regulatory networks is a challenging task in computational biology. Network component analysis (NCA) has become a powerful scheme to uncover regulatory networks behind complex biological processes. However, the performance of NCA is impaired by the high rate of false connections in binding information. In this paper, we integrate stability analysis with NCA to form a novel scheme, namely stability-based NCA (sNCA), for regulatory network identification. The method mainly addresses the inconsistency between gene expression data and binding motif information. Small perturbations are introduced to prior regulatory network, and the distance among multiple estimated transcript factor (TF) activities is computed to reflect the stability for each TF's binding network. For target gene identification, multivariate regression and t-statistic are used to calculate the significance for each TF-gene connection. Simulation studies are conducted and the experimental results show that sNCA can achieve an improved and robust performance in TF identification as compared to NCA. The approach for target gene identification is also demonstrated to be suitable for identifying true connections between TFs and their target genes. Furthermore, we have successfully applied sNCA to breast cancer data to uncover the role of TFs in regulating endocrine resistance in breast cancer.

Abstract Background Resistance to endocrine therapy in estrogen receptor-positive (ER+) breast cancer remains a significant clinical problem. Riluzole is FDA-approved for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis. A benzothiazole-based glutamate release inhibitor with several context-dependent mechanism(s) of action, Riluzole has shown anti-tumor activity in multiple malignancies, including melanoma, glioblastoma, and breast cancer. We previously reported that the acquisition of Tamoxifen resistance in a cellular model of invasive lobular breast cancer is accompanied by the upregulation of GRM mRNA expression and growth inhibition by Riluzole. Methods We tested the ability of Riluzole to reduce cell growth, alone and in combination with endocrine therapy, in a diverse set of ER+ invasive ductal and lobular breast cancer-derived cell lines, primary breast tumor explant cultures, and the estrogen-independent, ESR1 -mutated invasive lobular breast cancer patient-derived xenograft model HCI-013EI. Results Single-agent Riluzole suppressed the growth of ER+ invasive ductal and lobular breast cancer cell lines in vitro , inducing a histologic subtype-associated cell cycle arrest (G0-G1 for ductal, G2-M for lobular). Riluzole induced apoptosis and ferroptosis and reduced phosphorylation of multiple pro-survival signaling molecules, including Akt/mTOR, CREB, and Src/Fak family kinases. Riluzole, in combination with either Fulvestrant or 4-hydroxytamoxifen, additively suppressed ER+ breast cancer cell growth in vitro . Single-agent Riluzole significantly inhibited HCI-013EI patient-derived xenograft growth in vivo , and the combination of Riluzole plus Fulvestrant significantly reduced proliferation in primary breast tumor explant cultures. Conclusions Riluzole, alone or combined with endocrine therapy, may offer therapeutic benefits in diverse ER+ breast cancers, including lobular breast cancer.

Glioblastoma (GBM; grade 4 glioma) is a highly aggressive and incurable tumor. GBM has recently been characterized as highly dependent on alternative splicing, a critical driver of tumor heterogeneity and plasticity. Estrogen-related receptor beta (ERRβ, ESRRB, NR3B2 ) is an orphan nuclear receptor expressed in the brain, where alternative splicing of the 3’ end of the pre-mRNA leads to the production of three validated ERRβ protein products – ERRβ short form (ERRβsf), ERRβ2, and ERRβ exon 10-deleted (ERRβ-Δ10). Our prior studies have shown the ERRβ2 isoform to play a role in G2/M cell cycle arrest and induction of apoptosis, in contrast to the function of the shorter ERRβsf isoform in senescence and G1 cell cycle arrest. In this study, we sought to better define the role of the pro-apoptotic ERRβ2 isoform in GBM. We show that the ERRβ2 isoform is located in the nucleus, but also the cytoplasm. ERRβ2 suppresses GBM cell migration, interacts with the actin nucleation-promoting factor cortactin, and an ERRβ agonist is able to remodel the actin cytoskeleton and similarly suppress GBM cell migration. We further show that inhibition of the splicing regulatory cdc2-like kinases (CLKs) in combination with an ERRβ agonist shifts isoform expression in favor of ERRβ2 and potentiates inhibition of growth and migration in GBM cells and intracranial tumors.

In this work, we introduce CDGnet, an evidence-based network approach for recommending targeted cancer therapies, available as a user-friendly informatics tool. Our approach can be used to expand the range of options of targeted therapies for cancer patients who undergo molecular profiling. It considers biological pathway information specifically by looking at downstream targets of oncogenes and is personalized for individual patients via the user-inputted molecular alterations and cancer type. CDGnet integrates disparate sources of knowledge and provides results in a number of easily-accessible and usable forms, while separating targeted cancer therapies into categories in an evidence-based manner.

Temozolomide (TMZ) is a chemotherapy agent that adds mutagenic adducts to guanine, and is first-line standard of care for the aggressive brain cancer glioblastoma (GBM). Methyl guanine methyl transferase (MGMT) is a DNA repair enzyme that can remove O6-methyl guanine adducts prior to the development of catastrophic mutations, and is associated with TMZ resistance. However, inhibition of MGMT fails to reverse TMZ resistance. Guanines are essential nucleotides in many DNA and RNA secondary structures. In several neurodegenerative diseases (NDs), disruption of these secondary structures is pathogenic. We therefore took a structural view of TMZ resistance, seeking to establish the role of guanine mutations in disrupting critical nucleotide secondary structures. To test whether these have functional impacts on TMZ-resistant GBM, we focused on two specific guanine-rich regions: G-quadruplexes (G4s) and splice sites. Here we report broad sequence- and conformation-based changes in G4s in acquired or intrinsic TMZ resistant vs. sensitive GBM cells, accompanied by nucleolar stress and enrichment of nucleolar RNA:DNA hybrids (r-loops). We further show widespread splice-altering mutations, exon skipping, and deregulation of splicing-regulatory serine/arginine rich (SR) protein phosphorylation in TMZ-resistant GBM cells. The G4-stabilizing ligand TMPyP4 and a novel inhibitor of cdc2-like kinases (CLKs) partially normalize G4 structure and SR protein phosphorylation, respectively, and are preferentially growth-inhibitory in TMZ-resistant cells. Lastly, we report that the G4- and RNA-binding protein EWSR1 forms aberrant cytoplasmic aggregates in response to acute TMZ treatment, and these aggregates are abundant in TMZ resistant cells. Preliminary evidence suggests these cytoplasmic EWSR1 aggregates are also present in GBM clinical samples. This work supports altered nucleotide secondary structure and splicing deregulation as pathogenic features of TMZ-resistant GBM. It further positions cytoplasmic aggregation of EWSR1 as a potential indicator for TMZ resistance, establishes the possibility of successful intervention with splicing modulatory or G4-targeting agents, and provides a new context in which to study aggregating RNA binding proteins.

Abstract Acquired drug resistance in glioblastoma (GBM) presents a major clinical challenge and is a key factor contributing to abysmal prognosis, with less than 15 months median overall survival. Aggressive chemotherapy with the frontline therapeutic, temozolomide (TMZ), ultimately fails to kill residual highly invasive tumor cells after surgical resection and radiotherapy. Here, a 3D engineered model of acquired TMZ resistance is reported using two isogenically matched sets of GBM cell lines encapsulated in gelatin methacrylol hydrogels. Response of TMZ‐resistant versus TMZ‐sensitive GBM cell lines within the gelatin‐based extracellular matrix platform is benchmarked and drug response at physiologically relevant TMZ concentrations is further validated. The changes in drug sensitivity, cell invasion, and matrix‐remodeling cytokine production are shown as the result of acquired TMZ resistance. This platform lays the foundation for future investigations targeting key elements of the GBM tumor microenvironment to combat GBM's devastating impact by advancing the understanding of GBM progression and treatment response to guide the development of novel treatment strategies.

Purpose: Triple negative breast cancer (TNBC)/basal-like breast cancer (BLBC) is a highly aggressive form of breast cancer prevalent in African-American (AA) women. We previously reported that a small molecule agonist ligand for the orphan nuclear receptor estrogen-related receptor beta (ERRβ or ESRRB) has growth inhibitory and anti-mitotic activity in TNBC cell lines. In this study, we evaluate the association of ESRRB mRNA, copy number levels, and protein expression with demographic, clinicopathological, and gene expression features in breast tumor clinical specimens. Methods: ESRRB mRNA level expression and clinical associations were analyzed using RNAseq data. Array-based comparative genomic hybridization determined ESRRB copy number in AA and Caucasian women. Transcription factor activity was measured using promoter-reporter luciferase assays in TNBC cell lines. Semi-automatic quantification of immunohistochemistry measured ERRβ protein expression on a 150-patient tissue microarray series. Results: ESRRB mRNA expression is significantly lower in TNBC/BLBC vs. other breast cancer subtypes. There is no evidence of ESRRB copy number loss. ESRRB mRNA expression is correlated with the expression of genes associated with neuroactive ligand-receptor interaction, metabolic pathways, and deafness. These genes contain G/C-rich transcription factor binding motifs. The ESRRB message is alternatively spliced into three isoforms, which we show have different transcription factor activity in basal-like vs. other TNBC cell lines. We further show that the ERRβ2 and ERRβsf isoforms are broadly expressed in breast tumors at the protein level. Conclusions: Decreased ESRRB mRNA expression, and distinct patterns of ERRβ isoform subcellular localization and transcription factor activity are key features in TNBC/BLBC.

ABSTRACT Wnt ligand WNT4 is critical in female reproductive tissue development, with WNT4 dysregulation linked to related pathologies including breast cancer (invasive lobular carcinoma, ILC) and gynecologic cancers. WNT4 signaling in these contexts is distinct from canonical Wnt signaling yet inadequately understood. We previously identified atypical intracellular activity of WNT4 (independent of Wnt secretion) regulating mitochondrial function, and herein examine intracellular functions of WNT4. We further examine how convergent mechanisms of WNT4 dysregulation impact cancer metabolism. In ILC, WNT4 is co-opted by estrogen receptor α (ER) via genomic binding in WNT4 intron 1, while in gynecologic cancers, a common genetic polymorphism (rs3820282) at this ER binding site alters WNT4 regulation. Using proximity biotinylation (BioID), we show canonical Wnt ligand WNT3A is trafficked for secretion, but WNT4 is localized to the cytosol and mitochondria. We identified DHRS2, mTOR, and STAT1 as putative WNT4 cytosolic/mitochondrial signaling partners. Whole metabolite profiling, and integrated transcriptomic data, support that WNT4 mediates metabolic reprogramming via fatty acid and amino acid metabolism. Further, ovarian cancer cell lines with rs3820282 variant genotype are WNT4-dependent and have active WNT4 metabolic signaling. In protein array analyses of a cohort of 103 human gynecologic tumors enriched for patient diversity, germline rs3820282 genotype is associated with metabolic remodeling. Variant genotype tumors show increased AMPK activation and downstream signaling, with the highest AMPK signaling activity in variant genotype tumors from non-White patients. Taken together, atypical intracellular WNT4 signaling, in part via genetic dysregulation, regulate the distinct metabolic phenotypes of ILC and gynecologic cancers. Significance WNT4 regulates breast and gynecologic cancer metabolism via a previously unappreciated intracellular signaling mechanism at the mitochondria, with WNT4 mediating metabolic remodeling. Understanding WNT4 dysregulation by estrogen and genetic polymorphism offers new opportunities for defining tumor biology, precision therapeutics, and personalized cancer risk assessment.

Abstract Small molecule modulators are important tools to study both basic biology and the complex signaling of protein kinases. The cdc2-like kinases (CLK) are a family of four kinases that have garnered recent interest for their involvement in a diverse set of diseases such as neurodegeneration, autoimmunity, and many cancers. Targeted medicinal chemistry around a CLK inhibitor hit identified through screening of a kinase inhibitor set against a large panel of kinases allowed us to identify a potent and selective inhibitor of CLK1, 2 and 4. Here, we present the synthesis, selectivity, and potential binding site of this compound – SGC-CLK-1. We further show CLK2 has the highest binding affinity, and high CLK2 expression correlates with a lower IC 50 in a screen of multiple cancer cell lines. Finally, we show that SGC-CLK-1 not only reduces serine arginine rich (SR) protein phosphorylation, but also alters SR protein and CLK2 subcellular localization in a reversible way. Therefore, we anticipate that this compound will be a valuable tool for increasing our understanding of CLKs and their targets, SR proteins, at the level of phosphorylation and subcellular localization.

Breast tumors overexpressing human epidermal growth factor receptor (HER2) confer intrinsic resistance to endocrine therapy (ET), and patients with HER2/ estrogen receptor-positive (HER2+/HR+) breast cancer (BCa) are less responsive to ET than HER2-/ER+. However, real-world evidence reveals that a large subset of HER2+/ER+ patients receive ET as monotherapy, positioning this treatment pattern as a clinical challenge. In the present study, we developed and characterized two distinct in vitro models of ET-resistant (ETR) HER2+/ER+ BCa to identify possible therapeutic vulnerabilities.To mimic ETR to aromatase inhibitors (AI), we developed two long-term estrogen-deprived (LTED) cell lines from BT-474 (BT474) and MDA-MB-361 (MM361). Growth assays, PAM50 molecular subtyping, genomic and transcriptomic analyses, followed by validation and functional studies, were used to identify targetable differences between ET-responsive parental and ETR-LTED HER2+/ER+ cells.Compared to their parental cells, MM361 LTEDs grew faster, lost ER, and increased HER2 expression, whereas BT474 LTEDs grew slower and maintained ER and HER2 expression. Both LTED variants had reduced responsiveness to fulvestrant. Whole-genome sequencing of the more aggressive MM361 LTED model system identified exonic mutations in genes encoding transcription factors and chromatin modifiers. Single-cell RNA sequencing demonstrated a shift towards non-luminal phenotypes, and revealed metabolic remodeling of MM361 LTEDs, with upregulated lipid metabolism and antioxidant genes associated with ferroptosis, including GPX4. Combining the GPX4 inhibitor RSL3 with anti-HER2 agents induced significant cell death in both the MM361 and BT474 LTEDs.The BT474 and MM361 AI-resistant models capture distinct phenotypes of HER2+/ER+ BCa and identify altered lipid metabolism and ferroptosis remodeling as vulnerabilities of this type of ETR BCa.