Abstract Beyond its role in cellular homeostasis, autophagy plays anti- and pro-microbial roles in host-microbe interactions, both in animals and plants. One prominent role of anti-microbial autophagy is to degrade intracellular pathogens or microbial molecules, in a process termed xenophagy. Consequently, microbes evolved mechanisms to hijack or modulate autophagy to escape elimination. Although well-described in animals, the extent to which xenophagy contributes to plant-bacteria interactions remains unknown. Here, we provide evidence that Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) suppresses host autophagy by utilizing type-III effector XopL. XopL interacts with and degrades the autophagy component SH3P2 via its E3 ligase activity to promote infection. Intriguingly, XopL is targeted for degradation by defense-related selective autophagy mediated by NBR1/Joka2, revealing a complex antagonistic interplay between XopL and the host autophagy machinery. Our results implicate plant antimicrobial autophagy in depletion of a bacterial virulence factor and unravels an unprecedented pathogen strategy to counteract defense-related autophagy.

Abstract Phenotyping of model organisms grown on Petri plates is often carried out manually, despite the procedures being time-consuming and laborious. The main reason for this is the limited availability of automated phenotyping facilities, whereas constructing a custom automated solution can be a daunting task for biologists. Here, we describe SPIRO, the Smart Plate Imaging Robot, an automated platform that acquires time-lapse photos of up to four vertically oriented Petri plates in a single experiment, corresponding to 192 seedlings for a typical root growth assay and up to 2500 seeds for a germination assay. SPIRO is catered specifically to biologists’ needs, requiring no engineering or programming expertise for assembly and operation. Its small footprint is optimized for standard incubators, the inbuilt green LED enables imaging under dark conditions, and remote control provides access to the data without interfering with sample growth. SPIRO’s excellent image quality is suitable for automated image processing, which we demonstrate on the example of seed germination and root growth assays. Furthermore, the robot can be easily customized for specific uses, as all information about SPIRO is released under open-source licenses. Importantly, uninterrupted imaging allows considerably more precise assessment of seed germination parameters and root growth rates compared to manual assays. Moreover, SPIRO enables previously technically challenging assays such as phenotyping in the dark. We illustrate the benefits of SPIRO in proof-of-concept experiments which yielded a novel insight on the interplay between autophagy, nitrogen sensing and photoblastic response.

Abstract Arabidopsis root is a classic model system in plant cell and molecular biology. The sensitivity of plant roots to local environmental perturbation challenges data reproducibility and incentivizes further optimization of imaging and phenotyping tools. Here we present RoPod, an easy-to-use toolkit for low-stress live time-lapse imaging of Arabidopsis roots. RoPod comprises a dedicated protocol for plant cultivation and a customizable 3D-printed vessel with integrated microscopy-grade glass that serves simultaneously as a growth and imaging chamber. RoPod reduces impact of sample handling, preserves live samples for prolonged imaging sessions, and facilitates application of treatments during image acquisition. We describe a protocol for RoPods fabrication and provide illustrative application pipelines for monitoring root hair growth and autophagic activity. Furthermore, we showcase how the use of RoPods advanced our understanding of plant autophagy, a major catabolic pathway and a key player in plant fitness. Specifically, we obtained fine time resolution for autophagy response to commonly used chemical modulators of the pathway and revealed previously overlooked cell type-specific changes in the autophagy response. These results will aid a deeper understanding of the physiological role of autophagy and provide valuable guidelines for choosing sampling time during end-point assays currently employed in plant autophagy research.

Abstract Plant vacuoles play key roles in cellular homeostasis performing catabolic and storage functions, regulating pH and ion balance. The essential role of vacuoles for plant cell viability makes them a notoriously difficult subject to study impeding reaching the consensus on the mechanism of vacuolar establishment and the source of membrane material for it. Our previous suggestion of endoplasmic reticulum being the main membrane contributor for the tubular network of young vacuoles was recently challenged in a study proposing that young plant vacuoles comprise a set of individual vesicles that are formed de novo via homotypic fusion of multivesicular bodies (MVBs). To resolve these seemingly contradictory observations we have carefully revaluated both hypotheses. Here we provide a systematic overview of successive vacuolar biogenesis stages in Arabidopsis root, starting from the youngest cells proximate to the quiescent center. We validate our previous conclusions by demonstrating that the vacuolar dye BCECF is fully suitable for studying the organelle’s morphology and provide 3D models of vacuoles at all developmental stages. Furthermore, we established a customized FRAP assay and proved that even at the earliest stages of biogenesis, vacuoles comprise a connected network. Finally, we summarized the new and pre-existing evidence substantiating that vacuolar structures cannot originate solely from MVBs.

Summary Plants display a remarkable ability to adjust their growth and development to changes in environmental conditions, such as reduction in water availability. This high degree of plasticity is apparent not only as altered root and shoot growth rates, but also as changes to tissue patterning and cell morphology [1,2]. We have previously shown that Arabidopsis thaliana root xylem displays plastic developmental responses to limited water availability, mediated by non-cell autonomous action of abscisic acid, ABA [2]. Here, we show through analyses of ABA response reporters and tissue specific suppression of ABA signalling that xylem cells act as primary signalling centres for mediation of changes to both xylem cell fate and differentiation rate revealing a cell autonomous control of xylem development by ABA. Transcriptomic changes in response to ABA showed that members of the VASCULAR RELATED NAC DOMAIN (VND) transcription factor family are rapidly activated. Molecular and genetic analyses revealed that the two aspects of xylem developmental changes, cell fate and differentiation rate, are dependent on distinct members of this transcription factor family. Thus, this study provides insights into how different aspects of developmental plasticity can be interlinked, yet genetically independent of each other. Moreover, similarities in phenotypic and molecular responses to ABA in diverse species indicate an evolutionary conservation of the ABA-xylem development regulatory network among eudicots. Hence, this study gives molecular insights on how environmental stress promotes anatomical plasticity to key plant traits with potential relevance for water use optimization and adaptation to drought conditions.

Abstract Autophagy is a catabolic pathway conserved across eukaryotes. It plays a vital role in diverse stress responses by dismantling and recycling unnecessary or dysfunctional cellular parts and is orchestrated by the a u t opha g y related ATG proteins conserved among all eukaryotes 1,2 . An astounding conservation of autophagic machinery across eukaryotes highlights the fundamental role it plays in the cell’s homeostasis. In this study we discovered that ATG4-dependent delipidation of ATG8, previously considered as critical step in autophagy mechanism of all eukaryotes, is dispensable in Arabidopsis thaliana . Moreover, using ATG4-deficient background as a model system we uncovered specific function of two Arabidopsis ATG8 orthologs in autophagosome formation. Finally, we demonstrated that ATG8 delipidation is critical for autophagy in evolutionary distant from Arabidopsis species, unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii . These findings provide a new insight on plant-specific aspect of autophagy, highlight important differences between higher and lower plants and she new light on the reasons behind ATG8 gene family expansion.

Abstract Background Animals and plants diverged over one billion years ago and evolved unique mechanisms for many cellular processes, including cell death. One of the most well-studied cell-death programmes in animals, apoptosis, involves gradual cell dismantling and engulfment of cellular fragments, apoptotic bodies, through phagocytosis. However, rigid cell walls prevent plant cell fragmentation and thus apoptosis is not applicable for executing cell death in plants. Furthermore, plants are devoid of the key components of apoptotic machinery, including phagocytosis as well as caspases and Bcl-2 family proteins. Nevertheless, the concept of plant “apoptosis-like programmed cell death” (AL-PCD) is widespread. This is largely due to superficial morphological resemblances between plant cell death and apoptosis; in particular between protoplast shrinkage in plant cells killed by various stimuli and animal cell volume decrease preceding fragmentation into apoptotic bodies. Results Here, we provide a comprehensive spatio-temporal analysis of cytological and biochemical events occurring in plant cells subjected to heat shock at 40-55°C and 85°C, the experimental conditions typically used to trigger AL-PCD and necrotic cell death, respectively. We show that cell death under both conditions was not accompanied by membrane blebbing or formation of apoptotic bodies, as would be expected during apoptosis. Instead, we observed instant and irreversible permeabilization of the plasma membrane and ATP depletion. These processes did not depend on mitochondrial functionality or the presence of Ca 2+ and could not be prevented by an inhibitor of ferroptosis. We further reveal that the lack of protoplast shrinkage at 85°C, the only striking morphological difference between cell deaths induced by 40-55°C or 85°C heat shock, is a consequence of the fixative effect of the high temperature on intracellular contents. Conclusions We conclude that heat shock-induced cell death is an energy-independent process best matching definition of necrosis. Although the initial steps of this necrotic cell death could be genetically regulated, classifying it as apoptosis or AL-PCD is a terminological misnomer. Our work supports the viewpoint that apoptosis is not conserved across animal and plant kingdoms and demonstrates the importance of focusing on plant-specific aspects of cell death pathways.

Abstract To survive extreme desiccation, seeds enter dormancy that can last millennia. This dormancy involves the accumulation of protective but structurally disordered storage proteins through unknown adjustments of proteolytic surveillance mechanisms. Mutation of all six types II metacaspases (MCAs)-II in the model plant Arabidopsis revealed their essential role in modulating these proteolytic mechanisms. MCA-II mutant seeds fail to properly target at the endoplasmic reticulum (ER) the AAA ATPase Cell Division Cycle 48 (CDC48) to dispose of misfolded proteins. MCA-IIs cleave a CDC48 adaptor, the ubiquitination regulatory X domain-containing (PUX) responsible for localizing CDC48 to the lipid droplets. When cleaved, CDC48-PUX is inactivated and allows a lipid droplet-to-ER shuttling of CDC48, an important step in the regulation of seeds’ lifespan. In sum, we uncover antagonism between proteolytic pathways bestowing longevity. One-Sentence Summary Metacaspase proteases confer seed longevity by antagonizing CDC48 activity.

Autophagy is a major catabolic process in eukaryotes with a key role in homeostasis, programmed cell death and aging. In plants, autophagy is also known to regulate agriculturally important traits such as stress resistance, longevity, vegetative biomass and seed yield. Despite its significance, there is still a shortage of reliable tools modulating plant autophagy. Here we describe the first robust pipeline for identification of specific plant autophagy-modulating compounds. Our screening protocol comprises four phases: (i) high-throughput screening of chemical compounds in cell cultures of Nicotiana tabacum; (ii) confirmation of the identified hits in planta using Arabidopsis thaliana; (iii) further characterization of the effect using conventional molecular biology methods; (iv) verification of chemical specificity on autophagy in planta. The methods detailed here streamline identification of specific plant autophagy modulators and aid in unravelling the molecular mechanisms of plant autophagy.

Abstract Intracellular recycling via autophagy is governed by post-translational modifications of the autophagy-related (ATG) proteins. One notable example is ATG4-dependent delipidation of ATG8, a process that plays critical but distinct roles in autophagosome formation in yeast and mammals. Here, we aim to elucidate the specific contribution of this process to autophagosome formation in species representative of evolutionarily distant green plant lineages: unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii , with a relatively simple set of ATG genes, and a vascular plant Arabidopsis thaliana , harboring expanded ATG gene families. Remarkably, the more complex autophagy machinery of Arabidopsis renders ATG8 delipidation entirely dispensable for the maturation of autophagosomes, autophagic flux, and related stress tolerance; whereas autophagy in Chlamydomonas strictly depends on the ATG4-mediated delipidation of ATG8. Importantly, we also demonstrate the distinct impact of different Arabidopsis ATG8 orthologs on autophagosome formation, especially prevalent under nitrogen depletion, providing new insight into potential drivers behind the expansion of the ATG8 family in higher plants. Our findings underscore the evolutionary diversification of the molecular mechanism governing the maturation of autophagosomes in eukaryotic lineages and highlight how this conserved pathway is tailored to diverse organisms.