Summary Successful genome editing in primary human islets could reveal features of the genetic regulatory landscape underlying β cell function and diabetes risk. Here, we describe a CRISPR-based strategy to interrogate functions of predicted regulatory DNA elements using electroporation of a complex of Cas9 ribonucleoprotein (Cas9 RNP) and guide RNAs into primary human islet cells. We successfully targeted coding regions including the PDX1 exon 1, and non-coding DNA linked to diabetes susceptibility. CRISPR/Cas9 RNP approaches revealed genetic targets of regulation by DNA elements containing candidate diabetes risk SNPs, including an in vivo enhancer of the MPHOSPH9 gene. CRISPR/Cas9 RNP multiplexed targeting of two cis -regulatory elements linked to diabetes risk in PCSK1 , which encodes an endoprotease crucial for insulin processing, also demonstrated efficient simultaneous editing of PCSK1 regulatory elements, resulting in impaired β cell PCSK1 regulation and insulin secretion. Multiplex CRISPR/Cas9 RNP provides powerful approaches to investigate and elucidate human islet cell gene regulation in health and diabetes.

Summary Advances in organ transplantation benefit from development of genetically inbred animal strains with defined histocompatibility and cell-specific markers to distinguish donor and host cell subsets. For studies of pancreatic islet transplantation tolerance in diabetes, an invariant method to ablate host β cells and induce diabetes would provide an immense additional advantage. Here we detail development and use of B6 RIP-DTR mice, an immunocompetent line permitting diabetes induction with 100% penetrance. This inbred line is homozygous for the C57BL/6J major histocompatibility complex (MHC) haplotype and expresses the mutant CD45.1 allele in the hematopoietic lineage. β cell-specific expression of a high-affinity receptor for diphtheria toxin (DT) permits experimental β cell ablation and diabetes induction after DT administration. Diabetes reversal for over one year was achieved after transplantation with congenic C57BL/6J islets, but not with MHC-mismatched BALB/c islets, which were rapidly rejected. In summary, the generation of a C57BL/6J congenic line harboring the CD45.1 allele and Ins2-HBEGF transgene should advance studies of islet transplantation tolerance and mechanisms to improve islet engraftment and function, thereby optimizing development of cell replacement strategies for diabetes mellitus.

Abstract Frog metamorphosis, the development of an air-breathing froglet from an aquatic tadpole, is controlled by thyroid hormone (TH) and glucocorticoids (GC). Metamorphosis is susceptible to disruption by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo- p -dioxin (TCDD), an aryl hydrocarbon receptor (AHR) agonist. Krüppel-Like Factor 9 ( klf9 ), an immediate early gene in the endocrine-controlled cascade of expression changes governing metamorphosis, can be synergistically induced by both hormones. This process is mediated by an upstream enhancer cluster, the klf9 synergy module (KSM). klf9 is also an AHR target. We measured klf9 mRNA following exposures to triiodothyronine (T3), corticosterone (CORT), and TCDD in the Xenopus laevis cell line XLK-WG. klf9 was induced 6-fold by 50 nM T3, 4-fold by 100 nM CORT, and 3-fold by 175 nM TCDD. Co- treatments of CORT and TCDD or T3 and TCDD induced klf9 7- and 11-fold, respectively, while treatment with all 3 agents induced a 15-fold increase. Transactivation assays examined enhancers from the Xenopus tropicalis klf9 upstream region. KSM-containing segments mediated a strong T3 response and a larger T3/CORT response, while induction by TCDD was mediated by a region ∼1 kb farther upstream containing 5 AHR response elements (AHREs). This region also supported a CORT response in the absence of readily-identifiable glucocorticoid responsive elements, suggesting mediation by protein-protein interactions. A functional AHRE cluster is positionally conserved in the human genome, and klf9 was induced by TCDD and TH in HepG2 cells. These results indicate that AHR binding to upstream AHREs represents an early key event in TCDD’s disruption of endocrine-regulated klf9 expression and metamorphosis.

The widespread presence and distribution of metal-based nanoparticles (NPs) in soil is threatening crop growth and food security. However, little is known about the fate of Co

ABSTRACT HNF1A haploinsufficiency underlies the most common form of human monogenic diabetes (HNF1A-MODY) and hypomorphic HNF1A variants confer type 2 diabetes risk, but a lack of experimental systems has limited our understanding of how the transcription factor HNF1α regulates adult human islet function. Here, we combined human islet genetics, RNA sequencing, Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease (CUT&RUN) chromatin mapping, patch-clamp electrophysiology and transplantation-based assays to elucidate HNF1α-regulated mechanisms in mature pancreatic α and β cells. shRNA-mediated suppression of HNF1A in primary human pseudoislets led to blunted insulin output and dysregulated glucagon secretion both in vitro and after transplantation into immunocompromised mice, recapitulating phenotypes observed in HNF1A-MODY patients. These deficits corresponded with altered expression of genes encoding factors critical for hormone secretion, including calcium channel subunits, ATP-transporters and extracellular matrix constituents. Additionally, HNF1A loss led to upregulation of transcriptional repressors, providing evidence for a mechanism of transcriptional de-repression through HNF1α. CUT&RUN mapping of HNF1α DNA-binding sites in primary human islets verified that a subset of HNF1α-regulated genes were direct targets. These data provide unprecedented mechanistic links between HNF1A loss and diabetic phenotypes in mature human α and β cells.