Abstract In response to the SARS-CoV-2 pandemic, a highly increased sequencing effort has been established worldwide to track and trace ongoing viral evolution. Technologies such as nanopore sequencing via the ARTIC protocol are used to reliably generate genomes from raw sequencing data as a crucial base for molecular surveillance. However, for many labs that perform SARS-CoV-2 sequencing, bioinformatics is still a major bottleneck, especially if hundreds of samples need to be processed in a recurring fashion. Pipelines developed for short-read data cannot be applied to nanopore data. Therefore, specific long-read tools and parameter settings need to be orchestrated to enable accurate genotyping and robust reference-based genome reconstruction of SARS-CoV-2 genomes from nanopore data. Here we present poreCov, a highly parallel workflow written in Nextflow, using containers to wrap all the tools necessary for a routine SARS-CoV-2 sequencing lab into one program. The ease of installation, combined with concise summary reports that clearly highlight all relevant information, enables rapid and reliable analysis of hundreds of SARS-CoV-2 raw sequence data sets or genomes. poreCov is freely available on GitHub under the GNUv3 license: github.com/replikation/poreCov.

Our study investigated the effectiveness of Oxford Nanopore Technology for accurate outbreak tracing by resequencing a three-year-long Klebsiella pneumoniae outbreak with Illumina short-read sequencing data as the point of reference. We detected considerable base errors through cgMLST and phylogenetic analysis of genomes sequenced with Nanopore compared to the Illumina data, leading to the false exclusion of some outbreak-related strains from the outbreak cluster. Nearby methylation sites cause these errors and can also be found in other species besides K. pneumoniae. Based on this data, we explored PCR-based sequencing and a masking strategy, which both successfully addressed these inaccuracies and ensured accurate outbreak tracing. Additionally, we offer a bioinformatic workflow to identify and mask problematic genome positions in a reference-free manner. Without further technological developments, our study recommends PCR-based sequencing for outbreak tracing to avoid spurious base calls from Nanopore data.

Abstract Phage therapy has been proposed as a therapeutic alternative to antibiotics for treatment of chronic, biofilm-related P. aeruginosa infections. To get a deeper insight into the complex biofilm-phage interactions, we investigated in the present study the effect of three successive exposures to lytic phages of biofilms formed by the reference strains PAO1 and PA14 as well as of two sequential clinical P. aeruginosa isolates from the sputum of a patient with cystic fibrosis (CF). The Calgary device was employed as biofilm model and the efficacy of phage treatment was evaluated by measurements of the biomass stained with crystal violet (CV) and of the cell density of the biofilm bacterial population (CFU/ml) after each of the three phage exposures. The genetic alterations of P. aeruginosa isolates from biofilms exposed to phages were investigated by whole genome sequencing. We show here that the anti-biofilm efficacy of the phage treatment decreased rapidly with repeated applications of lytic phages on P. aeruginosa strains with different genetic background. Although we observed the maintenance of a small subpopulation of sensitive cells after repeated phage treatments, a fast recruitment of mechanisms involved in the persistence of biofilms to the phage attack occurred, mainly by mutations causing alterations of the phage receptors. However, mutations causing phage tolerant phenotypes such as alginate-hyperproducing mutants were also observed. In conclusion, a decreased anti-biofilm effect occurred after repeated exposure to lytic phages of P. aeruginosa biofilms due to recruitment of different resistance and tolerance mechanisms.