Abstract Approximately one-third of global CO 2 fixation occurs in a phase separated algal organelle called the pyrenoid. Existing data suggest that the pyrenoid forms by the phase-separation of the CO 2 -fixing enzyme Rubisco with a linker protein; however, the molecular interactions underlying this phase-separation remain unknown. Here we present the structural basis of the interactions between Rubisco and its intrinsically disordered linker protein EPYC1 (Essential Pyrenoid Component 1) in the model alga Chlamydomonas reinhardtii . We find that EPYC1 consists of five evenly-spaced Rubisco-binding regions that share sequence similarity. Single-particle cryo-electron microscopy of one of these regions in complex with Rubisco indicates that each Rubisco holoenzyme has eight binding sites for EPYC1, one on each Rubisco small subunit. Interface mutations disrupt binding, phase separation, and pyrenoid formation. Cryo-electron tomography supports a model where EPYC1 and Rubisco form a co-dependent multivalent network of specific low-affinity bonds, giving the matrix liquid-like properties. Our results advance the structural and functional understanding of the phase separation underlying the pyrenoid, an organelle that plays a fundamental role in the global carbon cycle.

ABSTRACT The photosynthetic CO 2 fixing enzyme ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) forms inhibited complexes with multiple sugar phosphates, including its substrate ribulose 1,5-bisphosphate. At least three classes of ATPases associated with diverse cellular activities (AAA+ proteins) termed Rubisco activases (Rcas) have evolved to remodel inhibited Rubisco complexes. The mechanism of green-type Rca found in higher plants has proved elusive, because until recently higher plant Rubiscos could not be expressed recombinantly. Towards identifying interaction sites between Rubisco and Rca, here we produce and characterize a suite of 33 Arabidopsis Rubisco mutants for their ability to be activated by Rca. We find that Rca activity is highly sensitive to truncations and mutations in the conserved N-terminus of the Rubisco large subunit. Both T5A and T7A substitutions cannot be activated by Rca, but present with increased carboxylation velocities. Our results are consistent with a model where Rca functions by transiently threading the Rubisco large subunit N-terminus through the axial pore of the AAA+ hexamer.

Abstract Autotrophy is the basis for complex life on Earth. Central to this process is rubisco - the enzyme that catalyzes almost all carbon fixation on the planet. Yet, with only a small fraction of rubisco diversity kinetically characterized so far, the underlying biological factors driving the evolution of fast rubiscos in nature remain unclear. We conducted a high-throughput kinetic characterization of over 100 bacterial form I rubiscos, the most ubiquitous group of rubisco sequences in nature, to uncover the determinants of rubisco’s carboxylation velocity. We show that the presence of a carboxysome CO 2 concentrating mechanism correlates with faster rubiscos with a median 5-fold higher rate. In contrast to prior studies, we find that rubiscos originating from α-cyanobacteria exhibit the highest carboxylation rates among form I enzymes (≈10 s -1 median versus <7 s -1 in other groups). Our study systematically reveals biological and environmental properties associated with kinetic variation across rubiscos from nature.

The enzyme rubisco catalyzes the first step of carbon assimilation in photosynthesis. Despite the massive flux of CO2 passing through this active site over billions of years, extant rubisco has relatively slow kinetics and is prone to off-target activity. In many growth regimes, this limits photosynthesis in planta. Many attempts have been made to improve the kinetic parameters of rubisco with limited success, potentially due to biochemical trade-offs. To understand the structural basis of constraints on rubisco, a comprehensive map of rubisco at the individual amino-acid level is needed. To that end we performed a deep mutational scan using a rubisco-dependent E. coli strain. By titrating CO2 concentrations it was possible to determine estimations for both catalytic rate (kcat) and substrate affinity (KM) of >99% of rubisco point mutants. Some positions were found to act as "rheostats" where some amino-acid substitutions reduced - while others improved - affinity for CO2. No individual point mutation was found to substantially improve the catalytic rate, but a number of highly phylogenetically conserved positions were found to tolerate mutations, indicating that a large portion of rubisco9s sequence space remains unexplored by nature and may serve as a resource for future protein engineering efforts. Together, these biochemical measurements inform our understanding of biochemical tradeoffs and will assist in future efforts to improve rubisco catalytic properties.

CO

Autotrophy is the basis for complex life on Earth. Central to this process is rubisco-the enzyme that catalyzes almost all carbon fixation on the planet. Yet, with only a small fraction of rubisco diversity kinetically characterized so far, the underlying biological factors driving the evolution of fast rubiscos in nature remain unclear. We conducted a high-throughput kinetic characterization of over 100 bacterial form I rubiscos, the most ubiquitous group of rubisco sequences in nature, to uncover the determinants of rubisco's carboxylation velocity. We show that the presence of a carboxysome CO