Abstract The Bacillus phage SPβ has been known for about 50 years, but only a few strains are avalible. We isolated four new wild type strains of the SPbeta species. Phage vB_BsuS-Goe14 introduces its prophage into the spoVK locus, previously not observed to be used by SPβ-like phages. We could also reveal the SPβ-like phage genome replication strategy, the genome packaging mode, and the phage genome opening point. We extracted 55 SPβ-like prophages from public Bacillus genomes, thereby discovering three more integration loci and one additional type of integrase. The identified prophages resembled four new species clusters and three species orphans in the genus Spbetavirus . The determined core proteome of all SPβ-like prophages consists of 38 proteins. The integration cassette proved to be not conserved even though present in all strains. It consists of distinct integrases. Analysis of SPβ transcriptomes revealed three conserved genes, yopQ , yopR , and yokI , to be transcribed from a dormant prophage. While yopQ and yokI could be deleted from the prophage without activating the prophage, damaging of yopR led to a clear-plaque phenotype. Under the applied laboratory conditions, the yokI mutant showed an elevated virion release implying the YokI protein being a component of the arbitrium system.

ABSTRACT Prophages need to tightly control their lifestyle to either be maintained within the host genome or enter the lytic cycle. The SPβ prophage present in the genome of Bacillus subtilis 168 was recently shown to possess an arbitrium system defining its replication stage. Using an historic B. subtilis strain harboring the heat-sensitive SPβ c2 mutant, we analyzed a key component of the lysis-lysogeny decision system called YopR, which is critical for maintenance of lysogeny. Here, we demonstrate that the heat-sensitive SPβ c2 phenotype is due to a single nucleotide exchange in the yopR gene, rendering the encoded YopR G136E protein temperature sensitive. Structural characterization of YopR revealed that the protein is a DNA-binding protein with an overall fold like tyrosine recombinases. Biochemical and functional analyses indicate that YopR has lost the recombinase function and the G136E exchange impairs its higher order structure and DNA binding activity. We further show that the heat-inducible SPβ excision of the c2 mutant still depends on the serine recombinase SprA. Finally, an evolution experiment identified the YosL protein of unknown function as a novel component of the lysis-lysogeny management system, as the presence of yosL is crucial for the induction of the lytic cycle of SPβ.

Filamentous vibriophages represent a massive repertoire of virulence factors which can be transferred across species boundaries, leading to the emergence of deadly pathogens. All filamentous vibriophages that were characterized until today were isolated from human pathogens. Considering frequent horizontal gene transfer among vibrios, we predict that other environmental isolates, including non-human pathogens also carry filamentous phages, of which some may encode virulence factors. The aim of this study was to characterize the phage repertoire, consisting of prophages and filamentous phages, of a marine pathogen, Vibrio alginolyticus. To do so, we sequenced eight different V. alginolyticus strains, isolated from different pipefish and characterised their phage repertoire using a combination of morphological analyses and comparative genomics. We were able to identify a total of five novel phage regions (three different Caudovirales and two different Inoviridae), whereby only those two loci predicted to correspond to filamentous phages (family Inoviridae) represent actively replicating phages. Unique for this study was that all eight host strains, which were isolated from different eukaryotic hosts have identical bacteriophages unique for this ecotype, suggesting a clonal expansion of this strain after the phages had been acquired by a common ancestor. We further found that co-occurrence of two different filamentous phages leads to within-host competition resulting in reduced phage replication by one of the two phages. We found virulence genes encoded on one of the two filamentous phages. The close phylogenetic relationship between filamentous phages from the present study with phages isolated from the human pathogen V. parahaemolyticus, suggest frequent movement of filamentous phages between different Vibrio species, which may have led to the emergence of the pathogenicity of the strains from the present study.

Abstract A new Vibrio strain K08M4 T was isolated from the broad-nosed pipefish Syngnathus typhle in the Kiel Fjord. Infection experiments revealed that K08M4 T is highly virulent for juvenile pipefish. Cells of strain K08M4 T are Gram-stain-negative, curved rod-shaped and motile by means of a single polar flagellum. The strain can grow aerobically at 9 to 40°C, at pH 4 to 10.5 and tolerates up to 12% (w/v) NaCl. The most prevalent (> 10%) cellular fatty acids of K08M4 T were C 16:1 ω 7 c and C 16:0. Whole-genome comparisons revealed that K08M4 T represents a separate evolutionary lineage which is distinct from other Vibrio species and falls within the Vibrio Splendidus clade. The genome is 4,886,292 bp in size, consists of two circular chromosomes (3,298,328 bp, 1,587,964 bp), and comprises 4,178 protein-coding genes and 175 RNA genes. In this study, we describe the phenotypic features of the new isolate and present the annotation and analysis of its complete genome sequence. Based on these data, the new isolate represents a new species for which we propose the name Vibrio syngnathi . The type strain is K08M4 T (=DSM 109818 T ). Supplementary material One supplementary figure and six supplementary table are available with the online version of the Manuscript.

Highlights•Local Bacillus subtilis isolates carry both common and distinct prophage elements•Phylogeny predicts prophage presence better than geographic origin•Prophages show mutual exclusion and co-dependence within host genomes•Most predicted prophages are not stress induced but increase host stress sensitivitySummaryProphages constitute a substantial portion of bacterial genomes, yet their effects on hosts remain poorly understood. We examine the abundance, distribution, and activity of prophages in Bacillus subtilis using computational and laboratory analyses. Genome sequences from the NCBI database and riverbank soil isolates reveal prophages primarily related to mobile genetic elements in laboratory strains. Distinct and previously unknown prophages in local isolates prompt an investigation into factors shaping prophage presence, with phylogenetic relatedness predicting the prophage repertoire slightly better than geographical origin. Data also show that prophages exhibit strong co-occurrence and exclusion patterns within genomes. Laboratory experiments indicate that most predicted prophages are cryptic, as they are not induced under DNA-damaging conditions. Importantly, stress responses increase with the number of predicted prophages, suggesting their influence on host physiology. This study highlights the diversity, integration patterns, and potential roles of prophages in B. subtilis, shedding light on bacterial genome evolution and phage-host dynamics.Graphical abstract

Abstract Antiviral defence systems build the prokaryotic immune system and their proper regulation is vital for survival and fitness. While it is important that they are readily available in case of infection, they need to be tightly controlled to prevent activation of an unnecessary cellular response. Here we describe how the bacterial cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling system (CBASS) uses its intrinsic protein modification system to regulate the nucleotide cyclase. By integrating a Type II CBASS system from Bacillus cereus into the cognate host Bacillus subtilis , we show that the Cap2 protein conjugates the cyclase exclusively to the conserved phage shock protein A (PspA) in the absence of phage. This cyclase-PspA conjugation is reversed after infection by the isopeptidase Cap3. Finally, we propose a model in which the cyclase is held in an inactive state by conjugation to PspA in the absence of phage and that this conjugation is released upon infection, priming the cyclase for activation.

Prophages account for a substantial part of most bacterial genomes, but the impacts on hosts remain poorly understood. Here, we combined computational and laboratory experiments to explore the abundance, distribution, and activity of prophage elements in Bacillus subtilis. NCBI database genome sequences and isolates from 1 cm3 riverbank soil samples were analyzed to provide insights at global and local geographical scales, respectively. Most prophages in wild B. subtilis isolates were related to mobile genetic elements previously identified in laboratory strains. Some large groups of prophages were closely related to completely uncharacterized yet functional Bacillus phages, or completely unknown. As certain prophage groups were unique to local isolates, we explored factors influencing prophages within a single genome. Phylogenetic relatedness was a slightly better predictor of host prophage repertoire than geographical origin. We show that cryptic phages can play a major role in acquisition and/or maintenance of other prophage elements both via strong antagonism or by co-dependence. Laboratory experiments showed that most predicted prophages may be cryptic, since they failed to induce under DNA-damaging stress conditions. Interestingly, the magnitude of stress responses remained proportional to the total number of prophage elements predicted, suggesting their importance in host physiology. This study highlights the diversity, integration patterns, and co-occurrence of prophages in B. subtilis and their potential impact on host evolution and physiology. Understanding these dynamics provides insight into bacterial genome evolution and prophage-host interactions, laying the groundwork for future experimental studies on the roles of phages in the ecology and evolution of this bacterial species.