Assembly of functional ribosomal subunits and successfully delivering them to the translating pool is a prerequisite for protein synthesis and cell growth. In S. cerevisiae, the ribosome assembly factor Reh1 binds to pre-60S subunits at a late stage during their cytoplasmic maturation. Previous work shows that the C-terminus of Reh1 inserts into the polypeptide exit tunnel (PET) of the pre-60S subunit. Unlike canonical assembly factors, which associate exclusively with pre-60S subunits, we observed that Reh1 sediments with polysomes in addition to free 60S subunits. We therefore investigated the intriguing possibility that Reh1 remains associated with 60S subunits after the release of the anti-association factor Tif6 and after subunit joining. Here, we show that Reh1-bound nascent 60S subunits associate with 40S subunits to form actively translating ribosomes. Using selective ribosome profiling, we found that Reh1-bound ribosomes populate open reading frames near start codons. Reh1-bound ribosomes are also strongly enriched for initiator tRNA, indicating they are associated with early elongation events. Using single particle cryo-electron microscopy to image cycloheximide-arrested Reh1-bound 80S ribosomes, we found that Reh1-bound 80S contain A site peptidyl tRNA, P site tRNA and eIF5A indicating that Reh1 does not dissociate from 60S until early stages of translation elongation. We propose that Reh1 is displaced by the elongating peptide chain. These results identify Reh1 as the last assembly factor released from the nascent 60S subunit during its pioneer round of translation.

The catalytic activity of the ribosome is mediated by RNA, yet proteins are essential for the function of the peptidyl transferase center (PTC). In eukaryotes, final assembly of the PTC occurs in the cytoplasm by insertion of the ribosomal protein Rpl10. We determine structures of six intermediates in late nuclear and cytoplasmic maturation of the large subunit that reveal a tightly-choreographed sequence of protein and RNA rearrangements controlling the insertion of Rpl10. We also determine the structure of the biogenesis factor Yvh1 and show how it promotes assembly of the P stalk, a critical element for recruitment of GTPases that drive translation. Together, our structures provide a blueprint for final assembly of a functional ribosome.

Eukaryotic ribosome biogenesis requires the action of approximately 200 trans-acting factors and the incorporation of 79 ribosomal proteins (RPs). The delivery of RPs to pre-ribosomes is a major challenge for the cell because RPs are often highly basic and contain intrinsically disordered regions prone to nonspecific interactions and aggregation. To counteract this, eukaryotes developed dedicated chaperones for certain RPs that promote their solubility and expression, often by binding eukaryotic-specific extensions of the RPs. Rps2 (uS5) is a universally conserved RP that assembles into nuclear pre-40S subunits. However, a chaperone for Rps2 had not been identified. Our lab previously characterized Tsr4 as a 40S biogenesis factor of unknown function. Here, we report that Tsr4 co-translationally associates with Rps2. Rps2 harbors a eukaryotic-specific N-terminal extension that was critical for its interaction with Tsr4. Moreover, Tsr4 perturbation resulted in decreased Rps2 levels and phenocopied Rps2 depletion. Despite Rps2 joining nuclear pre-40S particles, Tsr4 appeared to be restricted to the cytoplasmic. Thus, we conclude that Tsr4 is a cytoplasmic chaperone dedicated to Rps2.

The ribosomal protein Rpl1 (uL1 in universal nomenclature) is essential in yeast and constitutes part of the L1 stalk which interacts with E site ligands on the ribosome. Structural studies of nascent pre-60S complexes in yeast have shown that a domain of the Crm1-dependent nuclear export adapter Nmd3, binds in the E site and interacts with Rpl1, inducing closure of the L1 stalk. Based on this observation, we decided to reinvestigate the role of the L1 stalk in nuclear export of pre-60S subunits despite previous work showing that Rpl1-deficient ribosomes are exported from the nucleus and engage in translation. Large cargoes, such as ribosomal subunits, require multiple export factors to facilitate their transport through the nuclear pore complex. Here, we show that pre-60S subunits lacking Rpl1 or truncated for the RNA of the L1 stalk are exported inefficiently. Surprisingly, this is not due to a measurable defect in recruitment of Nmd3 but appears to result from inefficient recruitment of the Mex67-Mtr2 heterodimer.