Abstract The Drosophila polyadenosine RNA binding protein Nab2, which is orthologous to a human protein lost in a form of inherited intellectual disability, controls axon projection, locomotion, and memory. Here we define an unexpectedly specific role for Nab2 in regulating splicing of ∼150 exons/introns in the head transcriptome and link the most prominent of these, female retention of a male-specific exon in the sex determination factor Sex-lethal ( Sxl ), to a role in m 6 A-dependent mRNA splicing. Genetic evidence indicates that aberrant Sxl splicing underlies multiple phenotypes in Nab2 mutant females. At a molecular level, Nab2 associates with Sxl pre-mRNA and ensures proper female-specific splicing by preventing m 6 A hypermethylation by Mettl3 methyltransferase. Consistent with these results, reducing Mettl3 expression rescues developmental, behavioral and neuroanatomical phenotypes in Nab2 mutants. Overall these data identify Nab2 as a required regulator of m 6 A-regulated Sxl splicing and imply a broader link between Nab2 and Mettl3-regulated brain RNAs.

The RNA exosome is an evolutionarily conserved exoribonuclease complex that consists of a 3-subunit cap, a 6-subunit barrel-shaped core, and a catalytic base subunit. Missense mutations in genes encoding structural subunits of the RNA exosome cause a growing family of diseases with diverse pathologies, collectively termed RNA exosomopathies. The disease symptoms vary and can manifest as neurological defects or developmental disorders. The diversity of the RNA exosomopathy pathologies suggests that the different missense mutations in structural genes result in distinct in vivo consequences. To investigate these functional consequences and distinguish whether they are unique to each RNA exosomopathy mutation, we generated a collection of in vivo models using budding yeast by introducing pathogenic missense mutations in orthologous S. cerevisiae genes. We then performed a comparative RNA-seq analysis to assess broad transcriptomic changes in each mutant model. Three of the mutant models rrp4-G226D, rrp40-W195R and rrp46-L191H, which model mutations in the genes encoding structural subunits of the RNA exosome, EXOSC2, EXOSC3 and EXOSC5 showed the largest transcriptomic differences. Further analyses revealed shared increased transcripts enriched in translation or ribosomal RNA modification/processing pathways across the three mutant models. Studies of the impact of the mutations on translation revealed shared defects in ribosome biogenesis but distinct impacts on translation. Collectively, our results provide the first comparative analysis of several RNA exosomopathy mutant models and suggest that different RNA exosomopathy mutations result in in vivo consequences that are both unique and shared across each variant, providing more insight into the biology underlying each distinct pathology.

Sequencing of human patient tumors has identified recurrent missense mutations in genes encoding core histones. We report that mutations that convert histone H3 amino acid 50 from a glutamate to a lysine (H3E50K) support an oncogenic phenotype in human cells. Expression of H3E50K is sufficient to transform human cells as evidenced by a dramatic increase in cell migration and invasion, and a statistically significant increase in proliferation and clonogenicity. H3E50K also increases the invasive phenotype in the context of co-occurring BRAF mutations, which are present in patient tumors characterized by H3E50K. H3E50 lies on the globular domain surface in a region that contacts H4 within the nucleosome. We find that H3E50K perturbs proximal H3 post-translational modifications globally and dysregulates gene expression, activating the epithelial to mesenchymal transition. Functional studies using S. cerevisiae reveal that, while yeast cells that express H3E50K as the sole copy of histone H3 show sensitivity to cellular stressors, including caffeine, H3E50K cells display some genetic interactions that are distinct from the characterized H3K36M oncohistone yeast model. Taken together, these data suggest that additional histone H3 mutations have the potential to be oncogenic drivers and function through distinct mechanisms that dysregulate gene expression.

The RNA exosome is an evolutionarily-conserved ribonuclease complex critically important for precise processing and/or complete degradation of a variety of cellular RNAs. The recent discovery that mutations in genes encoding structural RNA exosome subunits cause tissue-specific diseases makes defining the role of this complex within specific tissues critically important. Mutations in the RNA exosome component 3 ( EXOSC3 ) gene cause Pontocerebellar Hypoplasia Type 1b (PCH1b), an autosomal recessive neurologic disorder. The majority of disease-linked mutations are missense mutations that alter evolutionarily-conserved regions of EXOSC3. The tissue-specific defects caused by these amino acid changes in EXOSC3 are challenging to understand based on current models of RNA exosome function with only limited analysis of the complex in any multicellular model in vivo . The goal of this study is to provide insight into how mutations in EXOSC3 impact the function of the RNA exosome. To assess the tissue-specific roles and requirements for the Drosophila ortholog of EXOSC3 termed Rrp40, we utilized tissue-specific RNAi drivers. Depletion of Rrp40 in different tissues reveals a general requirement for Rrp40 in the development of many tissues including the brain, but also highlight an agedependent requirement for Rrp40 in neurons. To assess the functional consequences of the specific amino acid substitutions in EXOSC3 that cause PCH1b, we used CRISPR/Cas9 gene editing technology to generate flies that model this RNA exosome-linked disease. These flies show reduced viability; however, the surviving animals exhibit a spectrum of behavioral and morphological phenotypes. RNA-seq analysis of these Drosophila Rrp40 mutants reveals increases in the steady-state levels of specific mRNAs and ncRNAs, some of which are central to neuronal function. In particular, Arc1 mRNA, which encodes a key regulator of synaptic plasticity, is increased in the Drosophila Rrp40 mutants. Taken together, this study defines a requirement for the RNA exosome in specific tissues/cell types and provides insight into how defects in RNA exosome function caused by specific amino acid substitutions that occur in PCH1b can contribute to neuronal dysfunction.Author Summary Pontocerebellar Hypoplasia Type 1b (PCH1b) is a devastating genetic neurological disorder that preferentially affects specific regions of the brain. Typically, children born with PCH1b have structural defects in regions of the brain including those associated with key autonomic functions. Currently, there is no cure or treatment for the disease. PCH1b is caused by mutations in the RNA exosome component 3 ( EXOSC3 ) gene, which encodes a structural component of the ubiquitous and essential multi-subunit RNA exosome complex. The RNA exosome is critical for both precise processing and turnover of multiple classes of RNAs. To elucidate the functional consequences of amino acid changes in EXOSC3 that cause PCH1b, we exploited well-established genetic approaches in Drosophila melanogaster that model EXOSC3 mutations found in individuals with PCH1b. Using this system, we find that the Drosophila EXOSC3 homolog (termed Rrp40) is essential for normal development and has an important function in neurons. Furthermore, PCH1b missense mutations modeled in Rrp40 cause reduced viability and produce neuronal-specific phenotypes that correlate with altered levels of target RNAs that encode factors with key roles in neurons. These results provide a basis for understanding how amino acid changes that occur in the RNA exosome contribute to neuronal dysfunction and disease.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

The RNA exosome is an essential ribonuclease complex involved in the processing and degradation of both coding and noncoding RNAs. We present three patients with biallelic variants in EXOSC5 , which encodes a structural subunit of the RNA exosome. The common clinical features of these patients comprise failure to thrive, short stature, feeding difficulties, developmental delays that affect motor skills, hypotonia and esotropia. Brain MRI revealed cerebellar hypoplasia and ventriculomegaly. The first patient had a deletion involving exons 5-6 of EXOSC5 and a missense variant, p.Thr114Ile, that were inherited in trans, the second patient was homozygous for p.Leu206His, and the third patient had paternal isodisomy for chromosome 19 and was homozygous for p.Met148Thr. We employed three complementary approaches to explore the requirement for EXOSC5 in brain development and assess the functional consequences of pathogenic variants in EXOSC5 . Loss of function for the zebrafish ortholog results in shortened and curved tails and bodies, reduced eye and head size and edema. We modeled pathogenic EXOSC5 variants in both budding yeast and mammalian cells. Some of these variants show defects in RNA exosome function as well as altered interactions with other RNA exosome subunits. Overall, these findings expand the number of genes encoding RNA exosome components that have been implicated in human disease, while also suggesting that disease mechanism varies depending on the specific pathogenic variant.

RNA exosomopathies, a growing family of tissue-specific diseases, are linked to missense mutations in genes encoding the structural subunits of the conserved 10-subunit exoribonuclease complex, the RNA exosome. Such mutations in the cap subunit gene cause the novel syndrome SHRF ( hort stature, earing loss, etinitis pigmentosa and distinctive acies). In contrast, exosomopathy mutations in the cap subunit gene cause pontocerebellar hypoplasia type 1b (PCH1b). Though having strikingly different disease pathologies, and exosomopathy mutations result in amino acid substitutions in similar, conserved domains of the cap subunits, suggesting that these exosomopathy mutations have distinct consequences for RNA exosome function. We generated the first model of the SHRF pathogenic amino acid substitutions using budding yeast by introducing the mutations in the orthologous gene . The resulting mutant cells have defects in cell growth and RNA exosome function. We detect significant transcriptomic changes in both coding and non-coding RNAs in the variant, , which models p.Gly198Asp. Comparing this mutant to the previously studied model of PCH1b mutation, , reveals that these mutants have disparate effects on certain RNA targets, providing the first evidence for different mechanistic consequences of these exosomopathy mutations. Congruently, we detect specific negative genetic interactions between RNA exosome cofactor mutants and but not . These data provide insight into how SHRF mutations could alter the function of the RNA exosome and allow the first direct comparison of exosomopathy mutations that cause distinct pathologies.

Abstract RNA binding proteins play important roles in the processing and precise regulation of RNAs. Highlighting the biological importance of RNA binding proteins is the increasing number of human diseases that result from mutations in genes that encode these proteins. We recently discovered that mutations in the ZC3H14 gene, which encodes an evolutionarily conserved polyadenosine RNA-binding protein, cause intellectual disability. Studies of the budding yeast orthologue of ZC3H14, Nuclear Poly(A) Binding protein 2 (Nab2), have provided insight into the functions of this protein. The NAB2 gene is essential in S. cerevisiae , and conditional nab2 mutants cause defects in a number of steps in RNA processing. To explore the critical functions of the Nab2/ZC3H14 protein family, we performed a high-copy suppressor screen on nab2 mutant cells. This screen identified genes encoding two core subunits of the RNA exosome, as well as Nrd1 and Ski7, nuclear and cytoplasmic cofactors of the RNA exosome, respectively. Nrd1 is an RNA binding protein that is part of the Nrd1-Nab3-Sen1 (NNS) complex, which plays an important role in transcription termination of non-coding RNAs. Ski7 is a GTP-binding protein that mediates interaction between the RNA exosome and the Ski complex, which targets RNA transcripts to the exosome for processing and degradation in the cytoplasm. To explore the functional interactions between the RNA exosome and Nab2, we employed RNA-seq analysis to identify the transcripts most impacted by overexpression of these exosome cofactors in nab2 mutant cells. This analysis revealed that many transcripts show small changes in steady-state levels, consistent with a global role of Nab2 in modulating transcript stability. This study uncovers functional interactions between the RNA exosome and Nab2 in both the nucleus and the cytoplasm.

ABSTRACT The RNA exosome is a conserved molecular machine that processes/degrades numerous coding and non-coding RNAs. The 10-subunit complex is composed of three S1/KH cap subunits (human EXOSC2/3/1; yeast Rrp4/40/Csl4), a lower ring of six PH-like subunits (human EXOSC4/7/8/9/5/6; (yeast Rrp41/42/43/45/46/Mtr3), and a singular 3’-5’ exo/endonuclease DIS3/Rrp44. Recently, several disease-linked missense mutations have been identified in genes encoding the structural cap and core subunits of the RNA exosome. In this study, we characterize a rare multiple myeloma patient missense mutation that was identified in the cap subunit gene EXOSC2 . This missense mutation results in a single amino acid substitution, p.Met40Thr, in a highly conserved domain of EXOSC2. Structural studies suggest this Met40 residue makes direct contact with the essential RNA helicase, MTR4, and may help stabilize the critical interaction between the RNA exosome complex and this cofactor. To assess this interaction in vivo , we utilized the Saccharomyces cerevisiae system and modeled the EXOSC2 patient mutation into the orthologous yeast gene RRP4 , generating the variant rrp4 M68T . The rrp4 M68T cells have accumulation of certain RNA exosome target RNAs and show sensitivity to drugs that impact RNA processing. Additionally, we identified robust negative genetic interactions the rrp4 M68T variant and RNA exosome cofactor mutants, particularly mtr4 mutant variants. This study suggests that the EXOC2 mutation identified in a multiple myeloma patient may impact the function of the RNA exosome and provides an in vivo assessment of a critical interface between the RNA exosome and Mtr4.

ABSTRACT Somatic missense mutations in histone genes turn these essential proteins into oncohistones, which can drive oncogenesis. Understanding how missense mutations alter histone function is challenging in mammals as mutations occur in a single histone gene. For example, described oncohistone mutations predominantly occur in the histone H3.3 gene, despite the human genome encoding 15 H3 genes. To understand how oncogenic histone missense mutations alter histone function, we leveraged the budding yeast model, which contains only two H3 genes, to explore the functional consequences of oncohistones H3K36M, H3G34W, H3G34L, H3G34R, and H3G34V. Analysis of cells that express each of these variants as the sole copy of H3 reveals that H3K36 mutants show different drug sensitivities compared to H3G34 mutants. This finding suggests that changes to proximal amino acids in the H3 N-terminal tail alter distinct biological pathways. We exploited the caffeine sensitive growth of H3K36 mutant cells to perform a high copy suppressor screen. This screen identified genes linked to histone function and transcriptional regulation, including Esa1, a histone H4/H2A acetyltransferase; Tos4, a forkhead-associated domain-containing gene expression regulator; Pho92, an N6-methyladenosine RNA binding protein and Sgv1/Bur1, a cyclin-dependent kinase. We show that the Esa1 lysine acetyltransferase activity is critical for suppression of the caffeine sensitive growth of H3K36R mutant cells while the previously characterized binding interactions of Tos4 and Pho92 are not required for suppression. This screen identifies pathways that could be altered by oncohistone mutations and highlights the value of yeast genetics to identify pathways altered by such mutations.