A new mass-spectrometry method has been developed to obtain high-resolution spectra of folded proteins bound to lipids; using this technique as well as X-ray crystallography provides evidence for membrane protein conformational change as a result of lipid–protein interaction. Many of the high-resolution membrane protein structures published recently are notable for the presence of lipids closely associated with the protein, prompting the question, how are these lipids influencing membrane complex structure? Carol Robinson and colleagues have developed a new ion mobility mass spectrometry (IM-MS) method that enabled them to obtain mass spectra of folded protein conformations bound to lipids. Using this method they identified lipids that altered the stability of MscL (mechanosensitive channel of large conductance), aquaporin Z and the ammonia channel. They then determined the X-ray crystal structure of the ammonia channel bound to one of these lipids (phosphatidylglycerol), which revealed how a conformational change in a specific loop led to the formation of a phosphatidylglycerol-binding site. The major conclusion from this work is that an individual lipid-binding event can change the stability of a membrane complex. On the cover, IM-MS captures a native membrane protein complex emerging from an ion mobility cell. Shown is the ammonia channel in apo, one- and two-lipid bound states. Previous studies have established that the folding, structure and function of membrane proteins are influenced by their lipid environments1,2,3,4,5,6,7 and that lipids can bind to specific sites, for example, in potassium channels8. Fundamental questions remain however regarding the extent of membrane protein selectivity towards lipids. Here we report a mass spectrometry approach designed to determine the selectivity of lipid binding to membrane protein complexes. We investigate the mechanosensitive channel of large conductance (MscL) from Mycobacterium tuberculosis and aquaporin Z (AqpZ) and the ammonia channel (AmtB) from Escherichia coli, using ion mobility mass spectrometry (IM-MS), which reports gas-phase collision cross-sections. We demonstrate that folded conformations of membrane protein complexes can exist in the gas phase. By resolving lipid-bound states, we then rank bound lipids on the basis of their ability to resist gas phase unfolding and thereby stabilize membrane protein structure. Lipids bind non-selectively and with high avidity to MscL, all imparting comparable stability; however, the highest-ranking lipid is phosphatidylinositol phosphate, in line with its proposed functional role in mechanosensation9. AqpZ is also stabilized by many lipids, with cardiolipin imparting the most significant resistance to unfolding. Subsequently, through functional assays we show that cardiolipin modulates AqpZ function. Similar experiments identify AmtB as being highly selective for phosphatidylglycerol, prompting us to obtain an X-ray structure in this lipid membrane-like environment. The 2.3 Å resolution structure, when compared with others obtained without lipid bound, reveals distinct conformational changes that re-position AmtB residues to interact with the lipid bilayer. Our results demonstrate that resistance to unfolding correlates with specific lipid-binding events, enabling a distinction to be made between lipids that merely bind from those that modulate membrane protein structure and/or function. We anticipate that these findings will be important not only for defining the selectivity of membrane proteins towards lipids, but also for understanding the role of lipids in modulating protein function or drug binding.

A Toxic Barrel Many studies have suggested that oligomers are an important toxic species in amyloid diseases such as Alzheimer's disease. In an effort to better define these oligomers, Laganowsky et al. (p. 1228 ) identified a segment of the fibril-forming protein αB crystalline (ABC) that forms both amyloid fibrils and a relatively stable oligomer. ABC oligomers were toxic in a cell viability assay and were recognized by an amyloid-oligomer–specific antibody. A crystal structure of the oligomers showed that six peptides formed an antiparallel barrel termed a cylindrin. Amyloid oligomers are likely to be structurally polymorphic, but cylindrin-like assemblies offer a model for these elusive structures.

Amyloid-beta (Aβ) aggregates are the main constituent of senile plaques, the histological hallmark of Alzheimer’s disease. Aβ molecules form β-sheet containing structures that assemble into a variety of polymorphic oligomers, protofibers, and fibers that exhibit a range of lifetimes and cellular toxicities. This polymorphic nature of Aβ has frustrated its biophysical characterization, its structural determination, and our understanding of its pathological mechanism. To elucidate Aβ polymorphism in atomic detail, we determined eight new microcrystal structures of fiber-forming segments of Aβ. These structures, all of short, self-complementing pairs of β-sheets termed steric zippers, reveal a variety of modes of self-association of Aβ. Combining these atomic structures with previous NMR studies allows us to propose several fiber models, offering molecular models for some of the repertoire of polydisperse structures accessible to Aβ. These structures and molecular models contribute fundamental information for understanding Aβ polymorphic nature and pathogenesis.

Mass spectrometry (MS) of intact soluble protein complexes has emerged as a powerful technique to study the stoichiometry, structure-function and dynamics of protein assemblies. Recent developments have extended this technique to the study of membrane protein complexes, where it has already revealed subunit stoichiometries and specific phospholipid interactions. Here we describe a protocol for MS of membrane protein complexes. The protocol begins with the preparation of the membrane protein complex, enabling not only the direct assessment of stoichiometry, delipidation and quality of the target complex but also the evaluation of the purification strategy. A detailed list of compatible nonionic detergents is included, along with a protocol for screening detergents to find an optimal one for MS, biochemical and structural studies. This protocol also covers the preparation of lipids for protein-lipid binding studies and includes detailed settings for a quadrupole time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer after the introduction of complexes from gold-coated nanoflow capillaries.

Abstract Small heat shock proteins alphaA and alphaB crystallin form highly polydisperse oligomers that frustrate protein aggregation, crystallization, and amyloid formation. Here, we present the crystal structures of truncated forms of bovine alphaA crystallin (AAC 59–163 ) and human alphaB crystallin (ABC 68–162 ), both containing the C‐terminal extension that functions in chaperone action and oligomeric assembly. In both structures, the C‐terminal extensions swap into neighboring molecules, creating runaway domain swaps. This interface, termed DS, enables crystallin polydispersity because the C‐terminal extension is palindromic and thereby allows the formation of equivalent residue interactions in both directions. That is, we observe that the extension binds in opposite directions at the DS interfaces of AAC 59–163 and ABC 68–162 . A second dimeric interface, termed AP, also enables polydispersity by forming an antiparallel beta sheet with three distinct registration shifts. These two polymorphic interfaces enforce polydispersity of alpha crystallin. This evolved polydispersity suggests molecular mechanisms for chaperone action and for prevention of crystallization, both necessary for transparency of eye lenses.

Significance We find that the core domain of the human molecular chaperone αB-crystallin can function effectively in preventing protein aggregation and amyloid toxicity. The core domain represents only half the total sequence of the protein, but it is one of the most potent known inhibitors of the aggregation of amyloid-β, a process implicated in Alzheimer’s disease. We have determined high-resolution structures of this core domain and investigated its biophysical properties in solution. We find that the excised domain efficiently prevents amyloid aggregation and thereby reduces the toxicity of the resulting aggregates to cells. The structures of these domains that we present should represent useful scaffolds for the design of novel amyloid inhibitors.

Significance The diverse environment of cellular membranes presents unique challenges in deciphering the roles that lipids play in modulating membrane protein structure and function. Here, we developed a native mass spectrometry approach to monitor binding of different lipid types to membrane proteins. We discovered that specific lipid−protein interactions can allosterically modulate the binding of lipids of different types. We also determined the structure of AmtB bound to cardiolipin, and mutation of residues involved in binding this lipid abolishes the observed allosteric effect. Our findings are of particular significance as they contribute to our general knowledge of how lipids modulate protein structure and function and how membrane proteins may recruit, through allostery, their own lipid microenvironment.

The proposed mechanism of fibril formation of transthyretin (TTR) involves self-assembly of partially unfolded monomers. However, the mechanism(s) of disassembly to monomer and potential intermediates involved in this process are not fully understood. In this study, native mass spectrometry and surface-induced dissociation (SID) are used to investigate the TTR disassembly mechanism(s) and the effects of temperature and ionic strength on the kinetics of TTR complex formation. Results from the SID of hybrid tetramers formed during subunit exchange provide strong evidence for a two-step mechanism whereby the tetramer dissociates to dimers that then dissociate to monomers. Also, the SID results uncovered a hidden pathway in which a specific topology of the hybrid tetramer is directly produced by assembly of dimers in the early steps of TTR disassembly. Implementation of SID to dissect protein topology during subunit exchange provides unique opportunities to gain unparalleled insight into disassembly pathways.